EMS处理甘蓝型油菜（Brassica napus）获得高油酸材料

 【目的】对EMS诱变甘蓝型油菜后代主要脂肪酸含量进行检测，并对M2代中获得的高油酸材料在分子水平进行分析。【方法】利用0.5%、1.0%和1.5%共3个EMS浓度处理甘蓝型油菜(湘油15号)，分析检测M1和M2代的主要脂肪酸含量;分别克隆高油酸突变体05-4和对照材料FAD2基因,对其进行核苷酸和氨基酸序列分析。【结果】浓度为1.5%时处理M2代发现了一株高油酸植株（油酸含量71%）;序列分析表明,高油酸材料FAD2A基因第614位碱基A突变成G导致天冬氨酸变成甘氨酸，FAD2B基因第59位碱基A突变成C导致天冬酰胺变成苏氨酸，在第722位碱基A突变成T导致酪氨酸变成苯丙氨酸。【结论】采用浓度1.5%的EMS处理甘蓝型油菜对油酸含量有一定的影响。高油酸材料FAD2A中第205位残基天冬氨酸变成甘氨酸和FAD2B中第241位残基酪氨酸变成苯丙氨酸都发生在油酸减饱和酶催化中心，从而影响了蛋白质的空间结构，导致油酸含量提高。     

甘蓝型油菜高油酸材料的正反交遗传研究

用4个高油酸品系和4个常规(低含量型)油酸品系为亲本材料,通过正反交试验,用FOSS近红外分析仪测定油酸含量,初步分析了甘蓝型油菜中突变产生的高油酸特性的遗传规律.结果表明,常规亲本与高油酸亲本油酸含量稳定;高油酸含量在正交组合F1代种子中表现,且其高油酸含量介于常规亲本油酸含量与高油酸亲本油酸含量均值之间;甘蓝型油菜的高油酸特性由显性多基因控制,并具有累加作用,不受母性遗传的影响.     

甘蓝型油菜FAD2基因调控序列的克隆及瞬时表达分析

油酸去饱和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）是广泛存在于植物中的一种能催化油酸脱氢生成亚油酸的还原酶。根据GenBank上已知的甘蓝型油菜FAD2基因设计引物,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片总DNA为模板,进行TAIL-PCR扩增,获得约1.4 kb片段并测序。序列比对结果说明该片段为已知的FAD2基因编码区上游序列。将该片段进行不同长度的5′端缺失,并用缺失后的序列替换pBI221-LUC质粒上的CaMV35S启动子,构建了甘蓝型油菜瞬时表达载体,进行油菜原生质体瞬时表达的初步研究,结果表明该序列5′端-669 bp至-1019 bp对报告基因表达水平有较大的影响。结合启动子预测分析结果,此片段中可能存在的赤霉素应答元件、光调控元件等顺式作用元件对FAD2基因的表达调控具有重要作用。     

甘蓝型油菜湿害相关基因BnLDH-1的克隆和表达分析

采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnLDH-1基因全长cDNA序列和基因组序列。BnLDH-1基因的DNA序列为1 432 bp,包含1个内含子;cDNA序列全长1 319 bp,含有1个1 053 bp的ORF,其编码蛋白含350个氨基酸。经预测发现,BnLDH-1蛋白存在LDH-1保守结构域。qRT-PCR结果表明,湿害诱导BnLDH-1表达,但在不同耐湿性甘蓝型油菜品种中,BnLDH-1的诱导表达水平不同。相关分析表明,湿害胁迫后48 h的BnLDH-1表达量与12份测试的甘蓝型油菜材料的耐湿指数呈显著负相关,其相关系数为0.73。     

根癌农杆菌介导的fad2 RNA干扰体基因转化甘蓝型油菜的研究

Δ12-油酸去饱和酶(Delta-12 oleate desaturase FAD2)是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶。对fad2基因表达进行抑制,可提高油菜种子油酸的相对含量。依据hpRNA介导的RNAi技术的原理,构建了以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。以甘蓝型油菜Y14-1的带柄子叶作为转化受体,利用根癌农杆菌介导法,将fad2RNA干扰体基因导入甘蓝型油菜中,获得了PPT抗性植株。同时还探讨了影响Y14-1品种转化频率的几个要素,为甘蓝型油菜的高效转化提供参考依据。对获得的再生植株进行GUS组织化学染色检测和PCR检测,证明外源基因已整合到油菜基因组中。     

双低油菜品种--宁油14号

甘蓝型油菜（B．napus L．）是国内外广泛栽培的主要油菜类型之一。由于生态条件的差异，甘蓝型油菜可分为冬性、半冬性和春性三种。各生长发育所要求的温、光条件有较大差别。我国于解放初期从日本引进甘蓝型油菜，经与我国白菜型油菜——南方油白菜（Brassica chinesis var oleifera Mak）杂交改良后形成了我国长江流域特有的半冬性甘蓝型油菜类型。     

双低油菜新品种“沪油15”及其高产栽培

甘蓝型油菜是上海郊区唯一的越冬油料作物，随种植业结构调整，上海的油菜种植面积将稳定在100万亩左右。但常规油菜品种的菜油中芥酸含量高达45％左右，亚油酸和油酸含量1低，使菜油营养价值欠佳；饼粒中硫代葡萄糖甙含量高达100μmol/g以上，因对家畜有害不能作蛋白饲料喂养畜禽。为提高油菜产品品质，上海市农科院作物所自80年代初开始进行甘蓝型油菜品质育种研究工作，在先后育成低芥酸油菜品种“申优青”和“沪秀青”，又低油菜品种“沪油12”和油菜“沪油14”的基础上，又育成高产、适应性广、较抗（耐）油菜菌病和病毒病的甘蓝型双低油菜新品种“沪油15”。     

甘蓝型油菜△^12-油酸去饱和酶基因RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制甘蓝型油菜△^12-油酸去饱和酶（delta-12 oleate desaturase FAD2）基因的表达，从而使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻，达到富集油酸，减少多不饱和脂肪酸含量的最终目的。依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验，选择油菜fad2基因片段（510bp）分别以反向和正向的形式插入到油菜napin启动子下游，并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入1个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子（83bp）及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。组装完成的fad2 RNAi载体转入到植物双元表达载体pCAMBIA3301，植物筛选标记基因采用抗灭生性除草剂PPT的选择基因bar及报告基因gus，从而构建成以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。     

芥菜型油菜优良性状导入甘蓝型油菜研究

分析了芥菜型油菜独具的优良性状,提出了通过种间杂交将芥菜型油菜优良基因导入甘蓝型油菜的基本程序,并对所获得的甘蓝型油菜黄籽超高油分、细胞质雄性不育恢复系、极早熟、高油酸和矮杆抗倒等新种质进行了介绍。     

甘蓝型油菜苗期管理技术

甘蓝型油菜在大理州油菜生产中占有主导地位，2000年甘蓝型油菜的播种面积约占全州油菜种植面积的96％，达14．4万亩。大理州各县(市)甘蓝型油菜逐渐进入苗期管理阶段，抓紧抓好幼苗管理，对油菜获得高产十分关键。     

固体碱法制备生物柴油组分生成动力学

[目的]探讨固体碱法制备生物柴油中组分油酸甲酯的生成动力学。[方法]以精制菜籽油和甲醇为原料,固体碱CaO/MgO作催化剂,菜籽油与甲醇在固体碱催化下进行酯交换反应制备生物柴油,用气相色谱法跟踪分析生物柴油(脂肪酸甲酯)的含量,考察生物柴油中组分油酸甲酯的生成动力学。[结果]动力学研究表明,固体碱CaO/MgO催化菜籽油和甲醇的酯交换反应速率方程为rA=dCp/dt=k1CA2。反应速率动力学方程分3个阶段,反应开始为引发阶段,逐步转变为增长阶段的2级反应,最终反应达到平衡阶段。油酸甲酯增长阶段反应活化能为58.48 kJ/mol,频率因子为9.18×105 L/(mol.min)。[结论]该研究为固体碱催化菜籽油与甲醇酯交换反应的动力学提供了理论基础。     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

甘蓝型油菜乙酰辅酶A羧化酶3个亚基基因的克隆及其表达

[目的]为构建乙酰辅酶A羧化酶的叶绿体表达载体奠定基础。[方法]以从甘蓝型油菜叶片中提取的叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆羧基转移酶β亚基基因。以从开花20~29 d后油菜幼胚中提取的总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆生物素羧化酶和生物素羧基载体蛋白的cDNA序列。最后,乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因被克隆到大肠杆菌表达载体中。[结果]SDS-PAGE分析结果表明乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因分别被克隆到大肠杆菌表达载体中。乙酰辅酶A羧化酶的3个亚基基因在大肠杆菌中的表达产物分别为76.6、44.0和81.5 kD,其融合蛋白分别占总菌体蛋白的12%、10%和6%。[结论]不同品种的甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白cDNA序列存在较大差异。     

甘蓝型油菜BnEIN3基因克隆及菌核病诱导表达

[目的]探讨甘蓝型油菜EIN3（BnEIN3）基因与菌核病抗性的关系。[方法]根据GenBank中已公布的拟南芥EIN-3基因的保守区及甘蓝型油菜EST序列，设计特异性引物，分别进行基因组PCR和RT-PCR扩增，克隆BnEIN3基因。对菌核病不同抗性的3个油菜品种中BnEIN3的表达进行荧光定量PCR检测分析。[结果]克隆得到1947bp的基因片段，与拟南芥EIN3一致性高达82%，有完整的开放阅码框，编码614个氨基酸，其中包含1个EIN3结构域，初步认定该片段为油菜BnEIN3基因。在高抗品种（D083）中，菌核病在侵染后期快速诱导BnEIN3上调表达，且显著高于中抗（中双9号）及高感品种（84039）中该基因的表达水平。在中抗及高感品种中，菌核病均抑制BnEIN3的表达，且中抗品种BnEIN3表达量一直大于高感品种。[结论]BnEIN3可能与油菜对菌核病抗性相关。     

甘蓝型油菜BnEIN3基因的克隆及菌核病诱导表达研究

乙烯不敏感转录调节基因（EIN3）是定位于细胞核上的乙烯信号转导下游元件，其作为转录因子启动一系列转录级联反应，从而激活乙烯诱导的防御相关基因的表达。拟南芥EIN3功能缺失突变体表现出对死体营养型病原菌高度敏感，表明该基因在抗死体营养型病原菌中发挥一定作用。为克隆甘蓝型油菜EIN3（BnEIN3）基因，该研究采用荧光定量PCR研究菌核病不同抗性的油菜品种接种核盘菌后，BnEIN3的表达变化及差异，初步探讨了BnEIN3在油菜菌核病防卫反应中的作用。     

油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响

 【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384 bp的片段，将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中，构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1，通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中，【结果】获得3棵转基因植株，PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量，结果表明：与非转基因对照相比，转基因植株的BnWRI1基因均受抑制，种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默，表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。     

花生油酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

根据克隆的花生油酸脱氢酶基因序列,选取高度保守的260 bp片段,插入植物双元表达栽体pFGC1008中,构建完成具有反向重复序列的pFGC/2nd表达栽体,利用RNAi以抑制内源目的基因表达,为获得高油酸亚油酸比值的花生种质奠定基础.     

油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建

丙酮酸羧化酶（ Ｐ Ｅ Ｐ）是控制油菜蛋白质／油脂含量比例的一个关键酶⒚本研究用 Ｐ Ｃ Ｒ 法扩增出了 Ｐ Ｅ Ｐ 基因片段,并将其 克隆到 ｐ Ｂ Ｓ Ｓ Ｋ＋ 的 Ｓｍ ａ Ⅰ位点⒚ Ｄ Ｎ Ａ 序列分析表 明克隆片段 的长度为 ５３０ｂｐ,其序列与报道序列相同⒚将该 Ｐ Ｅ Ｐ基因 片段反向插入 ｐ Ｉ Ｇ１２１ 质粒,构建了带 Ｐ Ｅ Ｐ 反义基因的超级双元载体并进行油菜的转化,目前已获得转基因植株⒚     

城市生活垃圾对石灰性褐土养分及油菜生长的影响

利用油菜盆栽试验研究了不同用量垃圾对石灰性生土和熟土全量养分、速效养分和油菜产量的影响。结果表明:随着垃圾施用量的增加,生土和熟土有机质和全氮、全磷、全钾含量都有增加的趋势,各处理与对照相比,全氮和全磷含量的差异性显著,而有机质和全钾含量的差异性不显著;随着垃圾施用量的增加,生土和熟土速效N、P、K含量都增加,且显著高于对照。施用垃圾的处理,油菜的干重和鲜重在生土和熟土上都高于对照,且提高了油菜中养分含量,特别是氮、磷元素的含量显著增加,对油菜生长具有良好的促进作用。这说明垃圾可以作为肥料资源将其农用,合理施用不仅可以提供给植物生长所需养分,提高产量,而且具有培肥改土的效果。     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。