Semi - quantitive Analysis of Isomaitooligosaccharide and Yeast Cell Wall on the Expression of Lysozyme Gene in the Liver of Trionyx sinensis

[目的]探讨低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖肝脏中溶菌酶基因表达的影响.[方法]利用CODEHOP设计简并引物,通过RT-PCR克隆中华鳖溶菌酶基因,然后通过半定量PCR分析低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因在肝脏中表达量的影响.[结果]通过克隆中华鳖溶菌酶基因,获得303 bp的溶菌酶基因片段,其GenBank登录号HQ437284,与GenBank登录号Q7LZQ1.3的中华鳖C型溶菌酶氨基酸序列同源性为75％.半定量分析结果表明,低聚异麦芽糖可显著提高中华鳖溶菌酶基因在肝脏中的表达量,而酵母细胞壁对中华鳖溶菌酶基因片段在肝脏中的表达量的影响不显著.[结论]该研究可为低聚异麦芽糖和酵母细胞壁在中华鳖养殖中的科学应用以及绿色环保添加剂的开发提供理论依据.     

低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖肠道菌群的影响

[目的]探讨低聚异麦芽糖和酵母细胞壁对中华鳖生长及肠道菌群的影响。[方法]将试验鳖分成5组,分别连续投喂基础饲料、添加酵母细胞壁的饲料、添加低聚异麦芽糖的饲料、联合添加酵母细胞壁和低聚异麦芽糖的饲料、间隔投喂添加酵母细胞壁和低聚异麦芽糖的饲料,然后对其肠道内好氧及兼性厌氧细菌的数量和组成进行研究。[结果]饲料中添加酵母细胞壁或低聚异麦芽糖对提高中华鳖体重无显著性影响,但饲料中联合添加酵母细胞壁和低聚异麦芽糖可显著提高中华鳖的存活率,单独添加则对存活率影响不显著。中华鳖肠道中以弗氏柠檬酸杆菌及少动鞘氨醇单胞菌为主,含有少量肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌,投喂添加酵母细胞壁或低聚异麦芽糖的饲料可显著降低肠道内细菌的含量,其主要减少弗氏柠檬酸杆菌的含量,并在一定程度上可提高少动鞘氨醇单胞菌的含量,而对肺炎克雷伯氏菌和嗜水气单胞菌含量影响不显著。[结论]该研究可为低聚异麦芽糖和酵母细胞壁在中华鳖养殖中的科学应用及开发绿色环保添加剂提供理论依据。     

低聚异麦芽糖对三角鲂生长及肠道菌群的影响

[目的]为低聚异麦芽糖在三角鲂养殖中的科学应用及开发绿色环保添加剂提供理论依据。[方法]在三角鲂基础饲料中添加不同水平的低聚异麦芽糖,对三角鲂的生长以及肠道内有益菌的数量和组成进行研究,探讨低聚异麦芽糖对三角鲂肠道菌群的影响。[结果]饲料中添加0.3%和0.6%低聚异麦芽糖可以显著提高三角鲂的存活率,添加0.6%和0.9%低聚异麦芽糖对三角鲂生长具有显著促进作用。添加0.6%和0.9%低聚异麦芽糖可以显著提高三角鲂肠道内双歧杆菌及乳酸杆菌的数量,并在一定程度上可以提高肠道菌群组成的多态性。[结论]三角鲂存活率的提高在一定程度上与改善肠道菌群组成、增强有益菌的生长有关。     

Cloning and expression of phytoene synthase gene in Strelitzia reginae

[目的]揭示八氢番茄红素合成酶(PSY)基因在鹤望兰花色形成中的作用.[方法]依据植物PSY基因的氨基酸保守序列设计引物,从鹤望兰黄色花萼中克隆PSY片段,对该片段进行序列比对和系统进化分析,并应用RT-PCR技术分析PSY基因在不同器官和花朵发育过程中的表达特性.[结果]克隆获得248 bp的PSY段,编码82个氨基酸,经注册,在GenBank的登录号为JN887695.由该片段推导出的氨基酸序列与其他植物的PSY蛋白有很高的同源性,其中与大蒜的亲缘关系最近,达90％,初步证明为目标基因.此外,该基因在鹤望兰始花期和黄色萼片中表达量最高.[结论]PSY可能在转录水平上对鹤望兰黄色花的形成起调控作用.     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

苹果梨果实着色相关PAL基因片段克隆及表达分析

以苹果梨果皮为试材,克隆了苹果梨果实着色相关PAL基因片段,GenBank登录号为JN120855。结果表明:该基因片段长度为407bp,与鸭梨PAL基因序列一致性达97%,与鸭梨氨基酸序列同源性最高,酶切位点分析表明,该PAL基因序列含有常用的限制性内切酶AccI的识别位点。半定量RT-PCR分析表明,随着果实的成熟,套袋果与未套袋果PAL基因的表达量都不断增加,但套袋果在果实成熟期的表达量明显高于未套袋果。     

3种微生物诱导的家蚕attacin基因异常表达形式的研究

[目的]研究家蚕抗菌肽attacin基因在不同诱导源诱导时的表达情况。[方法]应用3种外源微生物BmNPV、JM109以及农杆菌LBA4404对家蚕进行诱导,半定量PCR检测attacin基因在诱导后的家蚕血液和脂肪体的表达情况,对诱导表达产物进行克隆测序及进一步的分析。[结果]attacin基因在所有诱导后的脂肪体中均出现1条800 bp左右的特异表达条带,克隆测序（GenBank登录号：FJ373020）后发现其产生由正常表达形式的2个内含子未被剪接引起,且原序列第1内含子5′端的1个TGA终止密码子使得加长的特异表达序列翻译氨基酸时在此处终止,最终导致了attacin C末端结构的缺失。[结论]attacin基因有2种剪接形式,该研究对探明atta-cin基因在家蚕免疫中的作用具有参考价值。     

MTT法检测几种多糖和寡糖的体外细胞毒性

选用HL7702正常肝细胞系为靶细胞,用含不同浓度的多糖和寡糖的细胞培养液,通过MTT法进行细胞毒性检测并评价多糖和寡糖的细胞毒性。结果表明,Zymosan A、β-glucan、Laminarin和酵母细胞壁具有一定的细胞毒性,茶多糖、香菇多糖、黄芪多糖和海藻多糖等对细胞毒性较小,其中海藻多糖对细胞生长具有明显的促进作用。低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚木糖和水苏糖等4种寡糖在低浓度时均无毒性,在高浓度时低聚异麦芽糖具有一定的细胞毒性,而水苏糖表现出明显的剂量依赖性。     

白菜型油菜中WRKY基因的克隆与表达(英文)

[目的]为研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控。[方法]首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术(real-timerelative quantificationPCR,以下简称RT-qPCR)检测WRKY基因在ABA(100μmol/L)诱导不同时段的差异表达。[结果]在白菜型油菜中克隆到一段长度为680bp的WRKY基因片段和一段长度为933bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1h后表达量最高。[结论]成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。     

人泛素基因原核表达载体构建、表达及鉴定

[目的]构建含人泛素(Ubiquitin,Ub)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]应用PCR扩增人Ub基因片段,插入表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)PLysS,经诱导表达及鉴定。[结果]PCR扩增出约228bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约34000,纯化后鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人Ub蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

温和气单胞菌TL97528株丝氨酸蛋白酶基因片段克隆与序列分析

中华鳖(Trionyx sinensis)细菌性疾病主要由气单胞菌感染引起的,通过脱脂奶平板检测及酶活性试验得出温和气单胞菌TL97528株分泌的胞外蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,而丝氨酸蛋白酶是气单胞菌的主要毒力因子。根据已发表的嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列保守区域设计引物,PCR扩增出一长度为809 bp大小的特异片段,该序列在Genbank上的登录号为FJ357446。对该序列进行分析发现,已发表的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为AF253471)同源性为98%、与其他几株已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号分别为AF126213、AY841795、DQ127822、CP000462、CP000644、AF159142)同源性分别为98%、82%、82%、82%、81%、81%,与杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为X67043)同源性为80%。用DNAstar软件分析,与鳖源温和气单胞菌TK961010株的同源性为98%,...     

温和气单胞菌TL97528株丝氨酸蛋白酶基因片段克隆与序列分析

中华鳖(Trionyx sinensis)细菌性疾病主要由气单胞菌感染引起的,通过脱脂奶平板检测及酶活性试验得出温和气单胞菌TL97528株分泌的胞外蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,而丝氨酸蛋白酶是气单胞菌的主要毒力因子。根据已发表的嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列保守区域设计引物,PCR扩增出一长度为809 bp大小的特异片段,该序列在Genbank上的登录号为FJ357446。对该序列进行分析发现,已发表的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为AF253471)同源性为98%、与其他几株已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号分别为AF126213、AY841795、DQ127822、CP000462、CP000644、AF159142)同源性分别为98%、82%、82%、82%、81%、81%,与杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为X67043)同源性为80%。用DNAstar软件分析,与鳖源温和气单胞菌TK961010株的同源性为98%,...     

原子吸收法及原子荧光法测定中华鳖及黄沙鳖中微量元素铁、锌、硒的含量

[目的]检测野生黄沙鳖、养殖黄沙鳖以及养殖中华鳖肝脏、肌肉、裙边等不同组织中铁、锌、硒的含量。[方法]采用原子吸收光度法检测铁和锌含量,并用原子荧光光度法检测硒的含量。[结果]铁、锌、硒在野生黄沙鳖、养殖黄沙鳖以及养殖中华鳖不同组织中含量差异较大,铁的含量顺序三者均为肝脏〉蛋〉肉〉裙边,锌的含量顺序三者均为肌肉〉蛋〉肝脏〉裙边,硒的含量不同组织因品种不同有所差别。不同品种间铁、锌、硒的含量也存在较大差异。[结论]总体来说,黄沙鳖中铁、锌、硒的含量均大于中华鳖,野生黄沙鳖中铁、锌、硒的含量高于养殖黄沙鳖。     

GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达研究

[目的]对GmSARK启动子驱动IPT基因在拟南芥中的表达进行研究。[方法]分别克隆IPT基因及GmSARK基因启动子,构建它们的植物表达载体并进行拟南芥的转化,利用PPT(phosphinothricin)除草剂筛选,检测T1代转基因植株;对T1代转基因植株进行黑暗避光和干旱处理后进行半定量RT-PCR分析。[结果]成功克隆得到了IPT基因及GmSARK基因,并构建了它们的p3301-GmSARK-IPT植物表达载体;对T1代转基因植株的RT-PCR表明,目的基因mRNA水平上有所表达。[结论]为进一步研究GmSARK启动子驱动的IPT基因在抗逆中的作用奠定了基础。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。     

编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶基因的克隆和解析

[目的]为探索维生素B12生物合成的限速步骤奠定基础。[方法]提取费氏丙酸杆菌染色体DNA,利用Cassette和Cassette Primer的LA PCR技术克隆cobD的上游基因。将扩增的目的基因片段克隆至pGEM-T Easy Vector上,经PstⅠ酶切鉴定后对阳性克隆质粒进行测序,并应用Blast对所得碱基序列进行解析。[结果]经LA PCR扩增获得全长为1 085 bp的目的基因。经PstⅠ酶切鉴定,cobD基因成功克隆到pGEM-T Easy Vector上。测序结果表明,所得的基因为编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶的基因,与GenBank中cobD基因编码的氨基酸序列同源性为100%。[结论]在厌氧条件下,费氏丙酸杆菌具有与鼠伤寒沙门氏菌相似的合成途径。     

黄粉甲抗冻蛋白基因afp72 cDNA的克隆和序列分析

[目的]为抗冻蛋白基因afp72的体外表达和生物学功能研究奠定基础。[方法]从黄粉甲脂肪体中提取总RNA,通过RT-PCR克隆抗冻蛋白基因afp72,并构建克隆重组质粒pUCm-T-afp72。经双酶切后,将其与表达载体pMAL-p2X连接并转化到大肠杆菌TBI,构建表达重组质粒pMAL-p2X-afp72。[结果]afp72 cDNA长度为216 bpa;fp72的测序序列与GenBank中编码84个氨基酸的黄粉甲afps序列的同源性为89.48%a;fp72基因可能来自其他黄粉甲抗冻蛋白基因的突变或缺失;从蛋白水平上证实AFP72是一个抗冻蛋白,afp72是一个抗冻蛋白基因;表达重组质粒pMAL-p2X-afp72的构建是成功的。[结论]该研究为利用基因工程方法构建抗冻蛋白转基因植物提供了材料。     

鸟传染性支气管炎病毒类木瓜蛋白酶基因的克隆和表达

[目的]为探究鸟传染性支气管炎病毒(IBV)的感染和复制过程及其防治提供信息和途径。[方法]以鸟IBV的cDNA为模板,利用PCR技术克隆IBV类木瓜蛋白酶基因。将回收片段与pGEX-6p-1载体连接并转入大肠杆菌DH5α中。在IPTG诱导下将克隆的重组质粒在大肠杆菌BL21中进行表达,经纯化获得目标蛋白。[结果]克隆的类木瓜蛋白酶基因全长为924 bp,编码308个氨基酸的完整开放读码框。它与Genbank中IBV M41毒株类木瓜蛋白酶基因的序列完全一致,证实该基因为IBV的类木瓜蛋白酶基因。在IPTG诱导下,BL21菌株成功表达目标基因和GST融合蛋白,融合蛋白约为60 kD。经纯化和酶切后所得蛋白产物的分子量约为34 kD。[结论]该基因的成功克隆和表达为有关蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

温度·湿度·孵化介质对中华鳖孵化率的影响

[目的]探索中华鳖的适宜生态环境条件。[方法]通过正交试验,研究不同温度、相对湿度和孵化介质对中华鳖孵化率的影响。[结果]中华鳖胚胎发育的最优条件为:温度30℃,相对湿度为75%～85%,孵化介质粗砂、中砂、细砂的比例为1∶4∶1。此条件下,中华鳖的孵化率最高,为98.0%。根据其胚胎发育情况,将中华鳖的胚胎发育过程分为9期。[结论]该研究为中华鳖的人工孵化提供了理论基础与借鉴依据。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

为研究猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）NS1基因，建立快速、准确诊断猪细小病毒的方法，减少猪细小病毒造成的损失，笔者克隆了含有NS1基因的片段，并且与已登录猪细小病毒的相应序列进行比较，成功构建了原核表达重组质粒PET 30a／NS1，并在E.coli中进行了诱导表达。