杜氏盐藻耐盐分子机制的研究进展

盐藻是已知最为耐盐的真核生物之一,是研究植物高盐适应的最理想的模式生物.近年来,随着分子生物学技术的发展,盐藻耐盐分子机制的研究也备受国内外学者的瞩目.本文就盐藻适应高盐环境的渗透调节、盐藻耐盐相关基因和蛋白质以及盐胁迫信号转导途径等方面的研究做一简要的综述.     

杜氏盐藻无菌体系的建立

为建立杜氏盐藻无菌培养体系,试验选用卡那霉素、头孢霉素、氯霉素、链霉素、潮霉素和氨苄青霉素6种抗生素,分别测试盐藻细胞的抗生素耐受性和对盐藻藻液的除菌效果。结果表明,盐藻对氯霉素耐受性低,对头孢霉素和氨苄青霉素的耐受性较高;氯霉素、头孢霉素和氨苄青霉素单独处理对盐藻藻液的抑菌效果明显,卡那霉素、潮霉素和链霉素单独处理的抑菌效果较差;抗生素组合处理对盐藻藻液的除菌效果更强;应用50μg/mL氯霉素、100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL头孢霉素组合,经3次除菌处理和5次继代培养,建立了盐藻无菌培养体系。     

盐生杜氏藻D.salina和D.bardwil苹果酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

[目的]探讨利用盐生杜氏藻的MDH基因提高农作物耐盐性能的可行性。[方法]对盐生杜氏藻2个种(D.salina和D.bardwil)的苹果酸脱氢酶(MDH)进行克隆,并对它们的序列进行比较分析。[结果]盐生杜氏藻2个藻种MDH基因的全编码区序列分别长1 303 bp和1 288 bp,分别编码434和429个氨基酸的2个蛋白,经过亚细胞定位预测和相似性搜索,认为这两个蛋白应定位于叶绿体,即属于叶绿体型苹果酸脱氢酶。两个藻种的MDH基因编码区的核酸序列相似性为88.6%,氨基酸序列的相似性为93.5%,去除预测的信号肽序列后两者氨基酸的相似性达到97.4%。经过分子建模分析发现,D.salina的MDH相对于D.bardwil的MDH,大部分的氨基酸突变都位于蛋白分子表面,而且大多数位于分子表面的突变都是非极性氨基酸和极性氨基酸之间的转变。[结论]推测这些蛋白分子表面氨基酸残基的突变可能是D.salina的MDH对高盐浓度环境的适应结果。     

凡纳滨对虾烯醇酶基因Enolase的克隆及表达分析

以生长性状分离的凡纳滨对虾家系的肌肉组织.构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库.斑点杂交筛选获得Enolase基因,克隆获得全长编码区序列.序列分析表明,序列包含1 305 by的开放阅读框.推测编码的蛋自质含434个氨基酸.预测的分子量为47.4 ku,等电点为5.67.通过荧光定量PCR法研究了Fnolase基因在凡纳滨对虾的不同组织和不同生长期的肌肉组织中的表达情况,结果显示,Fnolase基因在凡纳滨对虾的心脏、肝胰腺、肌肉、胃、肠、眼柄、鳃和血等组织或器官中都有表达;在肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺中表达量最低;在日龄为125 d的对虾肌肉组织中表达量量高,在口龄为80 d的对虾肌肉组织中表达量最低.     

杜氏盐藻基因DsSP的克隆、分析和原核表达(英文)

[目的]克隆盐藻淀粉磷酸化酶基因,并初步分析其基本性质和表达蛋白。[方法]采用RT-PCR和RACE的方法克隆基因;生物信息学系统分析其性质;构建原核表达载PGS21a-DsSP转化于E.coli BL21表达蛋白,采用GST-SefinoseTMKit和Western Blot分别纯化、检测该融合蛋白。[结果]成功克隆出1种淀粉磷酸化酶(GenBank accession No.KF061044)命名为DsSP;分析得到了其基本性质并预测了该蛋白的亚细胞定位、二级结构和三级结构;该融合蛋白在上清和包涵体中均存在,且对上清蛋白成功纯化;Western Blot检测表明其在E.coli.BL21中成功表达。[结论]为进一步阐明DsSP的功能及作用机制奠定了理论基础。     

小地老虎V-ATP酶A亚基基因的克隆与分析

V-ATP酶是一种ATP依赖型的多亚基质子泵,广泛存在于多种生物的内膜和质膜上,参与生物体内多种重要的生理生化反应,为了进一步研究V-ATP酶,克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因。以鳞翅目昆虫小地老虎(Agrotis ypsilon)的中肠组织为材料,利用RACE技术克隆小地老虎V-ATP酶A亚基基因全长。结果表明:克隆得到A亚基基因序列2 693bp,其中CDS区1 851bp,编码616个氨基酸,翻译的蛋白质分子质量为68.06ku,等电点为5.14,含有3个N-糖基化位点。基因同源性分析结果说明该基因与棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟草天蛾(Manduca sexta)、小菜蛾(Plutella xyllostella)均有较高的同源性。A亚基基因序列已提交至GenBank并获得登录号KM434187。     

包埋-脱水法常温和低温下保存盐生杜氏藻的研究

用包埋-脱水法在常温和低温保存盐生杜氏藻（Dunaliella salina）,探讨了温度、光暗和含水量等因素对存活率的影响。结果表明：盐生杜氏藻在4℃下保存6个月后的最高存活率达到54．4％。保存后的藻细胞经过恢复培养后,其生长力可达到保存前的水平。包埋-脱水法操作简单,无需复杂设备,在藻类种质的中期保存中有广阔的应用前景。     

大肠杆菌焦磷酸酶基因的克隆和序列分析

按ＣＴＡＢ法提取大肠杆菌Ｋ－１２的ＤＮＡ,应用ＰＣＲ技术获得目的基因片段（ＰＰａｓｅ基因）,低熔点胶回收后,在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下,将目的基因克隆到ｐＵＣｍ－Ｔ载体上,并转化ＪＭ１０９感受态菌中。转化获得的克隆提取质粒ＤＮＡ,０．８％琼脂糖凝胶电泳分析,并进行ＰＣＲ扩增鉴定、序列分析证明插入片段确为ＰＰａｓｅ基因。本文用ＰＣＲ技术扩增并克隆大肠杆菌焦磷酸酶基因,为导入甜菜选育高含糖量品种奠定基     

抗稻瘟病菌链霉菌JK-1聚酮合酶合成基因的克隆

利用前人已报道的经典的KA系列、LC系列及MT系列简并引物扩增Streptomyces JK-1基因组DNA,共获得10条目标片段,所有序列的GC含量均在70%左右,具有链霉菌的高GC含量特性。其中片段1与S.coelicolor A3(2)的AL939117.1基因序列在50%可比对序列上有90%的相似性,片段2与S.ambofaciens ATCC 23877的Am238663.1基因序列在95%可比对序列上有81%的相似性,片段10与S.avermitilis MA-4680的BA000030.3基因序列在93%可比对序列上有85%的相似性。其余7条序列与GeneBank数据库中的序列无相似性。分析结果表明,已获得了新的PKS基因的部分片段,这些片段可以作为下一步获得PKS基因全长的有效探针。     

杜氏盐藻电击转化体系的优化

[目的]构建盐藻高效遗传转化体系,以利于在细胞内组装靶标代谢途径,进而以盐藻为生物反应器规模化生产类胡萝卜素、生物燃油等高值产品。[方法]以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为受体,以来源于高油植物斑鸠菊(Vernonia galamensis)编码DGAT酶的基因VgDGAT1a为靶基因,以pCAMBIA3301为表达载体,利用电击法进行遗传转化,优化转化条件和相关参数,并对转化体进行分子检测。[结果]杜氏盐藻对除草剂草铵膦敏感,固体和液体培养筛选阳性转化体的草铵膦浓度分别为20mg·L~(-1)和40mg·L~(-1)。优化的盐藻电转化技术条件包括:培养7d的藻细胞为受体,质粒浓度6mg·L~(-1),电击参数为0.4kV和4ms。盐藻转化率达2.63‰,比现有转化效率提高约1.14倍。分子检测显示靶基因VgDGAT1a基因成功转入杜氏盐藻并高效表达。[结论]建立的优化电击转化方法显著提高了盐藻转化效率,在高等植物遗传转化中,常用的抗除草剂草铵膦Bar基因可用作盐藻基因转化的选择标记,植物表达载体pCAMBIA3301亦可用于盐藻遗传转化。     

维生素B1对盐藻生长的影响

[目的]为了探索VB1对盐藻生长的影响.[方法]将盐藻接入不同浓度的VB1培养液中,研究其对盐藻色素形成、细胞生长与蛋白质积累的影响.[结果]VB1可使盐藻β-胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b形成增多、细胞繁殖加快、蛋白质积累量增大.[结论] VB1可促进盐藻的生长.     

杜氏盐藻新型遗传转化方法的建立(英文)

本研究采用LiAc/PEG介导法首次成功地将外源基因导入盐藻细胞,组织化学染色发现转基因盐藻为蓝色,表明外源的基因在盐藻细胞中得到了成功表达。同时还进行了生长状态、转化温度、质粒浓度等因素对转化率影响的研究,优化了转化条件。结果表明,盐藻处于对数生长早期、质粒DNA浓度为600μg/ml、转化温度29℃是最理想的转化条件,其转化率为74.8‰。PCR扩增和PCR-Southern杂交结果证明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。     

巴夫杜氏藻GAPDH基因部分序列的克隆

3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中的一个关键酶,由于其基因表达量相对恒定.因此在定量和半定量PCR试验中常被用作内源参照基因来确定目标基因的相对表达量.从巴夫杜氏藻(Dunaliella pmva)中克隆GA PDH基因,并对基因序列进行了分析.以巴夫杜氏藻cDNA为模板,根据GAPDH的保守序列设计引物...     

北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析

根据报道的10几种真菌漆酶氨基酸序列的保守区域设计了一对简并引物,以北方梭囊孔菌总DNA为模板,通过PCR扩增到一个1 201 bp的基因片段.将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示99个序列,全部为漆酶基因及其类似基因,因而认为克隆到的片段就是北方梭囊孔菌漆酶基因片段.经过与同源性最高的粗毛革孔菌（laccase lcc1）同一区段编码区序列进行ClustalW比较,其中有6个间隔区,确定为内含子区.去除内含子后,推导的氨基酸序列为286个残基.经与其他几种真菌漆酶的氨基酸序列进行ClustalW比对,同源性均在51%以上.      

猪围脂滴蛋白基因cDNA部分片段的克隆及序列分析

采用比较基因组学和简并PCR方法,根据人、小鼠和大鼠等物种PLIN基因的序列,设计简并引物,克隆了猪PLIN基因包括起始密码子的部分cDNA序列,大小为978 bp(GenBank登录号为EU416277)。该序列与人和小鼠相应序列的相似性分别为87%和83%,编码325个氨基酸,具有1个PAT-1结构域、2个蛋白激酶A位点和1个富含谷氨酸的酸性基序,预测的氨基酸序列与人、小鼠、牛和绵羊相应区域序列的相似性分别为87%,82%,86%,86%。该基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。     

7种植物花瓣ACO基因的克隆与分析

为获得通用的适用于植物花瓣ACO基因克隆与检测的引物,根据Genbank中收录的双子叶木本植物的ACO基因序列,设计1对简并引物,并用其对随机选择的7种植物(紫罗兰、多头菊、冬樱、迎春、云南杜鹃、垂丝海棠、山茶)的花瓣的RNA进行PCR扩增。结果发现：从7种植物花瓣中都能扩增出约800 bp的特异片段,登录Genbank发现均未被注册,将序列提交Genbank数据库,获得7种植物花瓣ACO基因的登录号(JX503067、JX503068、JX503069、JX503070、KC112390、KC112392、KC112393);在NCBI上进行blast比对,发现所克隆的7个ACO基因均与其他植物的ACO基因有一定的序列相似性,其中冬樱ACO基因与千叶桃花ACO基因同源性最高,为98%,迎春ACO基因与中华猕猴桃ACO6基因的同源性最低,为88%,将7个ACO基因的片段进行多序列比较分析,发现两两之间序列平均相似性为77%。     

水稻10kD富硫醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

以水稻广陆矮４号为材料，利用ＰＣＲ技术从水稻基因组中扩增出１０ｋＤ富硫醇溶蛋白基因，并将其插入质粒ｐＵ１８的ＳｍａⅠ位点，导入大肠杆菌ＪＭ１０９中筛选重组子。经酶切鉴定、ＰＣＲ检测获得含目的基因的克隆。采用银染测序法进行序列分析。结果表明，克隆的基因含４０２ｂｐ的ＯＰＦ，与Ｍａｓｕｍｕｒａ发表序列的同源率为８７．３％。编码１３３个氨基酸，包括２４个氨基酸的信号肽序列，推测的氨基酸序列与Ｍａｓｕｍｕｒａ的序列同源列率为８１．３％。其中含硫氨基酸占２４．１％。     

大米草Na^＋/H^＋泵基因3′cDNA末端的克隆和序列分析

根据大米草Na^＋/H^＋泵基因已克隆的一段基因组DNA序列的保守区设计引物,利用RACE技术,从大米草中分离并克隆出Na^＋/H^＋泵基因的一段cDNA片段,长度为793 bp.该cDNA片段编码区推导出的氨基酸序列在NCB I网站上BLAST,结果显示该氨基酸序列与多种植物的Na^＋/H^＋泵的C端氨基酸序列相似.该结果可以推断所克隆的cDNA片段为大米草Na^＋/H^＋泵基因的3′端.将该cDNA对应的氨基酸序列与以前克隆的大米草Na^＋/H^＋泵基因的一段DNA所对应的氨基酸序列拼接,然后与多种植物的Na^＋/H^＋泵进行对位排列.结果显示,该氨基酸序列与芦苇、水稻、小麦、大麦、玉米、拟南芥和滨藜等植物的Na^＋/H^＋泵基因对应的氨基酸序列有较高的相似性,其中与禾本科植物的相似性程度更高.