波尔山羊卵泡卵母细胞的体外培养和输卵管配子移植

从4头同期发情与超数排卵的因重复采胚不孕的供体波尔山羊卵巢采得24枚卵泡卵母细胞(18枚卵丘卵母细胞，6枚裸卵)，其中9枚卵丘卵母细胞直接与获能后的精子实施配子输卵管内移植，4头受体均未受孕；其余15枚进行26h成熟培养，经培养后其中9枚卵丘卵母细胞中有6枚卵丘扩散，3枚未扩散；6枚裸卵因均退化而弃去。9枚卵丘卵母细胞移植至4头受体后有两头妊娠并如期产羔各一头。     

山羊配子输卵管内移植受精技术

以2只屡配不孕"波尔山羊"、1只F2代杂交波尔山羊、6只"徐淮白山羊"为卵子供体,经同期发情和超排处理,腹腔镜观察卵巢卵泡发育状况后筛选出供手术采卵供体。从7只供体中采集到可用卵子39枚,采用输卵管内配子移植(GIFT)技术植入受体徐淮母羊12只。移植后连续3个发情周期妊娠鉴定表明,12只受体中有6只未返情,妊娠率为50%。2只受体产单羔,1只受体产3羔(难产)。共移植39枚卵子,5枚发育为后代,配子受精发育率为13%。     

牛活体采卵及其在体外受精中的应用

利用超声波活体采卵技术(ovumpick-up,OPU)对奶牛的活体采卵技术进行了研究,探讨活体采卵频率以及用FSH处理后对卵母细胞回收的影响,并对比了活体采卵与屠宰场采卵体外受精后胚胎的发育。结果表明:每周采2次与每周采1次可获卵母细胞数差异显著;用FSH在采卵前3d处理不发情母牛和发情母牛,发现两组平均获卵数差异不显著,且回收率和优质卵母细胞率差异不显著;活体采卵和屠宰场采卵的优质卵母细胞数和囊胚率差异显著。     

羔羊超数排卵及体外受精技术研究

用FSH+ PMSG和FSH+LH 2种处理方法,对8只6周龄的高山细毛羊进行超数排卵试验,4只作对照组,并对采集到的卵子进行体外受精,探索羔羊超数排卵的可行性及体外受精的效果.结果表明:2组处理共获得发育卯泡583个,回收卵母细胞255枚.卵母细胞经体外培养24 h后与上游法获能的精子进行体外受精,48 h后2组处理...     

羊胚胎生产和胚胎移植

综述了绵羊和山羊胚胎生产和胚胎移植各项技术的研究进展，包括超数排卵、体内受精与发育；成熟卵泡卵母细胞与腔前卵泡卵母细胞的体外成熟、体外受精与发育；利用极体生产胚胎以及利用胚胎生产胚胎的胚胎分割与细胞核移植克隆技术；胚胎的回收、检胚与胚胎分级，以及供体与受体的同期发情处理和胚胎移植技术。     

山羊不同来源卵母细胞体外受精的研究

从屠宰场搜集的小母羊(3-6月)卵巢卵母细胞(A组)、成年母羊卵巢卵母细胞(B组)及成年母羊超排后活体所取母细胞(C组)进行了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)及受精后早期胚胎体外培养(IVC)的比较研究.研究发现:(1)A组平均每个卵巢获取的卵母细胞数极显著高于B组(10.6±2.6 vs 2.5±1.5,P＜0.01),与C组相比差异不显著(10.6±2.6 vs11.0±2.0,P＞0.05),但获取的优良可用卵丘卵母细胞复合体(COCS)数A组极显著高于B组(4.5±2.5 vs 1.6±1.5,P＜0.01),却显著低于C组(4.5±2.5 vs 8.5±2.5,P＜0.05);(2)A,B,C组获取的可用卵母细胞在M 199±10%EGS±20 ng/mL EGF培养液中培养后的体外培养成熟率分别为63.8%,65%和68.3%,差异均不显著(P＞0.05);(3)3种来源途径的可用卵母细胞体外成熟后用mDM液获能受精处理并培养于TCM 199-卵丘颗粒细胞饲养层(cc)共培养体系中的卵裂率(37.5%,35.0%和40%)无显著差异;12枚活体来源卵母细胞生产的2-8细胞胚移植给4只同期化受体,其中1只母羊怀孕并产下2只"试管"羔羊(16.7%).研究表明:初情期前小母羊比成年母羊可提供更多可用于体外受精的卵母细胞,进而提高雌性动物的早期繁殖潜能;对遗传性能较好的品种或个体可通过超数排卵处理后利用合适的采卵设备进行活体采卵,以进行有针对性的体外受精及相关胚胎工程研究,提高体外受精和胚胎生产效率.     

波尔山羊胚胎移植奶山羊应用技术研究

1999～2000年,在成都波尔山羊种羊场进行了波尔山羊胚胎移植奶山羊应用技术研究.对12只供体用FSH减量法进行超排处理,回收胚胎257枚,平均21.4±11.1枚,其中可用胚206枚,平均17.2±8.33枚.将170枚可用胚移植给同期发情的78只雅安奶山羊受体,其中2只在妊娠2个月后流产,49只受体羊妊娠到期产下纯种波尔山羊羔88只,移植受体妊娠率65.4%(51/78),产羔受体比率62.8%(49/78),胚胎成羔率51.8%(88/170).平均每只波尔山羊供体通过胚胎移植增加纯种后代7.33只.其中RB52号波尔山羊获16枚胚胎,移植给8只奶山羊(双胚),全部妊娠,产下13只纯种波尔山羊,胚胎成羔率达81.3%.结果表明,波尔山羊胚胎移植奶山羊能获得较高的妊娠率和胚胎成羔率,已可从研究阶段发展到产业化应用.     

卵母细胞经体外成熟、受精及用输卵管细胞共培养后产羔

卵母细胞经体外成熟、受精处理后,转移到中间受体母羊体内培养。5天后,回收到59％的卵子,其中31枚(38％)达到桑椹或囊胚期胚胎,移植给6只受体母羊,结果5只妊娠,其中4只保持妊娠,并产羔羊9只(43％)。本试验,72个卵母细胞成熟和体外受精,用羊输卵管细胞共培养5天,31个受精卵(43％)发育到非植入桑椹胚,21个胚胎移植到11只受体体内,结果2只(18％)妊娠,并产2只公羔。结果表明:体外成熟和受精的羊卵与绵羊输卵管上皮细胞共培养以通过预移植阶段,这对其进一步发育到移植时期是适合的。     

不同处理方法对波尔山羊胚胎移植效果的影响

为了提高波尔山羊繁殖力,应用两种处理方法对波尔山羊进行了同期发情及超数排卵研究。结果表明:两种处理方法(PG-FSH法与CIDR-FSH法)对波尔山羊的同期发情率无显著差异(P>0.05),波尔山羊同期发情率达到92.5%;CIDR-FSH法处理的供体卵巢上的平均黄体数及平均采卵数均显著高于(P<0.05)PG-FSH法,而两者的平均获胚数与平均可用胚数差异不显著(P>0.05),说明CIDR-FSH法对波尔山羊的超排处理效果要优于PG-FSH法。试验还表明,移胚数量对受体妊娠率无显著影响(P>0.05),而对受体产羔率有极显著(P<0.01)的影响。移植双胚可以提高受体的产羔率。     

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCRRFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%（123/180）,囊胚发育率为25.20%（31/123）;在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60 d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。     

布尔山羊胚胎移植试验研究

2001年9-12月份，应用2种超排方案对35只布尔山羊（其中经产羊30只，处女羊5只）进行了超排处理，并对180只受体进行了胚胎移植。结果表明：35只供体共回收胚胎471枚，可用胚为349枚，可用胚胎率为74.10％（349/471），每只平均获胚胎11.91枚，只均可用胚9.97枚。其中经产羊30只，平均每只获胚胎12.43枚，只均可用胚胎10.37枚；处女羊5只，平均每只获胚胎8.8枚，只均可用胚胎7.6枚。鲜胚移植受体180只，每只1枚，妊娠率为63.89％（115/180），另外，试验表明，不同剂量的FSH对超排效果也有一定的影响。     

卵丘细胞对活体取卵来源的裸卵在体外成熟中的作用

本文探讨了卵丘细胞对活体取卵(ovumpickup,OPU)来源的裸卵在体外成熟中的作用。实验分3组:自然裸卵组(NO),裸卵独自成熟培养;共成熟组(CM),自然裸卵与A级卵丘卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes,COCs)共成熟培养;非裸卵组(NN),正常AB级COCs成熟后,去除卵丘再进行体外受精与体外培养。结果显示:NN组的成熟率最高,其卵裂率及囊胚率高于NO组,但与CM组相似;CM组的成熟率与NO组没有显著差异,但卵裂率和囊胚率均比NO组高。表明OPU来源的裸卵和A级COCs共成熟能显著改善裸卵的发育能力;卵丘细胞对卵母细胞的促成熟作用可直接作用于裸卵,促进裸卵的成熟及随后的发育。     

小型农牧场及农户波尔山羊胚胎移植关键技术研究

从小型农牧场及农户特点出发,探讨在这些场(户)进行波尔山羊胚胎移植时,供体超数排卵、受体同期发情、供受体羊胚胎回收和移植操作等关键技术对胚胎移植效率的影响。结果表明,调整供、受体母羊的发情周期并采用优化超排程序和同期发情程序,可获得理想的超排和同期发情结果,有效手术供体回收卵数平均达到(17.31±6.93)枚,可用胚(14.96±6.28)枚;受体同期发情率达到94.28%(2125/2254),手术受体利用率为86.55%(1602/1851)。严格而熟练的手术操作可提高供体利用次数,获得理想的胚胎移植结果,将2648枚胚胎移植给1602只受体后,妊娠率达到66.85%(1071/1602),其中1044只受体妊娠足月,产羔1320只。     

奶山羊精子体外获能与体外受精

供体用FSH+LH超排,卵母细胞从注LH后约30h回收。将获能精子与10枚卵母细胞在受精液(mDM+输卵管上皮细胞)和培养液(mDM+30％供体羊血清)中连续培养(38℃)24h后,有6枚卵受精,抛出第二极体。将6枚受精卵移植到3只受体中,有1只妊娠,产出1只试管母山羊。初步表明,本试验的奶山羊精子体外获能与体外受精程序是简便而有效的。     

延边奶山羊羔羊超数排卵及体外成熟的研究

[目的]对延边奶山羊羔羊超数排卵及体外成熟进行研究.[方法]以延边奶山羊为试验对象,研究不同超排方案对羔羊卵泡发育的影响,比较了羔羊超排处理后与成年母羊卵巢内的卵母细胞体外成熟的差异.[结果]延边奶山羊的最佳超排方案为CIDR＋PMSG 800 IU注射1次＋FSH（加拿大）20 IU/次,间隔12 h注射6次;宁波产FSH超排效果不稳定,卵泡回收率低.成年母羊卵母细胞的体外成熟率显著高于母羔羊超排卵母细胞.[结论]该研究为建立延边奶山羊JIVET技术体系提供依据.     

山羊胚胎克隆的研究

应用细胞核移植技术，把未分化或处于不同发育阶段的胚胎分裂球或细胞移入成熟的去核卵母细胞，并使之融合，成为Ｇ＿０代克隆卵。将Ｇ＿０代克隆卵移入同期发情的山羊输卵管中培养５ｄ，回收得到克隆胚，选择其中正常发育至８～１６细胞的克隆胚，将其胚胎细胞再移入成熟的去核卵母细胞，并进行电融合，构成Ｇ＿１代再克隆卵。１２９枚Ｇ＿０代克隆卵和１４３枚Ｇ＿１代再克隆卵移入同期发情的山羊输卵管，获得Ｇ＿０代克隆羊２只和Ｇ＿１代再克隆羊４只。介绍了产生克隆动物的各个技术环节以及这些环节与克隆动物出生率的关系。     

辽宁绒山羊卵泡卵母细胞体外成熟的分析

为了获取高质量的卵泡卵母细胞,提高绒山羊体外胚胎生产的效率,采用切割法与抽吸法采集卵泡卵母细胞,并对获得的可用卵母细胞进行了体外成熟培养,表明结果:切割法获得的可用卵母细胞较多,明显增加了用于体外成熟的卵母细胞数。在温度37.0、38.0、39.0℃条件下对卵母细胞进行体外成熟培养,成熟率分别为67.74%、72.00%、75.38%,表明39.0℃适合辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟培养。在温度39.0℃条件下用10%胎牛血清(FCS)的TCM-199培养液培养卵母细胞的成熟率为78.57%,而在10g/LBSA的TCM-199培养液中培养卵母细胞的成熟率为74.07%,二者差异不显著。     

南德温牛胚胎移植研究

为了研究适于大型肉牛———南德温牛的超数排卵及胚胎移植技术,选择11头适龄南德温牛为供体牛和9头南阳牛为受体牛,进行CIDR-FSH-PG超数排卵和胚胎移植试验。结果表明,供体牛均按时发情,反应率100%,共采胚99枚,获可用胚胎65枚,平均每头5.91枚,可用胚胎率65.0%,可用胚胎等级A、B、C级分别为38.5%、30.8%、30.7%,共移植受体9头,妊娠6头,受胎率66.67%,共产犊9头,其中产双犊3头,其余胚胎进行了冷冻保存。     

奶牛活体采卵的影响因素分析

针对活体生物材料缺乏,活体采卵技术(Ovum pick-up)应运而生,因其具有系谱清楚适于科学研究而成为获取卵母细胞的主要途径之一。因此,研究活体采卵影响因素具有重要意义。就活体采卵在采卵间隔周期、超排处理、高产牛所处年龄段、患繁殖疾病与否及连续采卵进行试验,研究其采卵效率及对卵巢生理机能的影响。结果显示,①采卵间隔时间不同,以每周2次采卵所获卵母细胞数要多于每周1次的,差异不显著,但每周2次的优质卵母细胞率高于每周1次,且差异显著;②经超排处理后获卵母细胞数显著高于对照组,优质卵母细胞率有所提高,差异不显著;③青年牛和成年牛的平均获卵数和优质卵母细胞率差异均不显著;④健康牛平均获卵数显著高于患有繁殖疾病的牛只,优质卵母细胞率也显著高于患牛;⑤奶牛连续采卵和1次采卵的平均获卵率和优质卵母细胞率差异均不显著。综上,奶牛活体采卵受很多因素的影响,上述5方面的因素为主要影响因素。     

促性腺激素促进雄性小鼠体内卵巢移植体卵泡卵母细胞生长发育的研究

 【目的】探索外源促性腺激素对卵巢在雄性受体内生长、卵泡发育和卵母细胞成熟与发育能力的影响。【方法】将1日龄小鼠卵巢移植到7～12周龄雄性小鼠肾囊下,回收前用促性腺激素对受体进行处理或不处理,同龄雌性小鼠用促性腺激素进行处理后作为对照。移植21 d后回收移植卵巢,观测移植体的回收率及生长和卵泡发育;对卵母细胞进行体外成熟、体外受精,观察2-细胞胚和囊胚发育率。【结果】移植21 d后,未处理组移植体回收率为85.4%,与处理组（90.7%）差异不显著（P＞0.05）。未处理组移植体卵泡发育至成熟阶段,回收卵母细胞均处在GV期,平均每枚移植体回收卵母细胞数为（41.4±25.8）枚,2-细胞胚胎发育率为17.5%,未能发育至囊胚;处理组移植体有黄体形成,有的卵泡中有扩展的卵丘卵母细胞复合体,平均回收卵母细胞数为（33.4±20.1）枚,其中MⅡ期卵母细胞为（8.5±7.1）枚,GV期、MⅡ期卵母细胞受精后2-细胞胚胎的发育率分别为33.9％和44.3%,囊胚发育率分别为0.48%和6.3%;试验组间回收卵母细胞数差异不显著（P＞0.05）,2-细胞胚胎发育率、囊胚发育率差异极显著（P＜0.01）。试验组卵母细胞2-细胞胚胎发育率显著低于对照组（P＜0.01）,处理组MⅡ期卵母细胞囊胚发育率与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】外源促性腺激素对雄性小鼠卵巢移植体具有促进卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育的作用,但不增加卵母细胞产量。