酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白

通过酵母双杂交实验技术筛选小鼠VDR相互作用的蛋白质,评价不同蛋白与VDR的结合活性,以期获得基于互作影响雄性生殖能力基因。扩增小鼠VDR完整CDS序列,克隆至诱铒表达载体pGBKT7,经菌落PCR、DNA测序鉴定,获得重组载体pGBKT7-VDR。随后将重组载体转化至酿酒酵母AH109,并进行毒性和自激活检测;然后与含小鼠cDNA文库的Y187酵母杂交,获得阳性克隆,经HindⅢ酶切,测序分析VDR互作候选蛋白的核酸序列,再检测β-半乳糖苷酶活性,评价候选蛋白与VDR作用力的强弱。结果表明,从小鼠cDNA文库中获得12个与VDR互作的候选蛋白。初步检测到12个蛋白可能与VDR互作,其中3个蛋白因子可能与VDR结合并调控蛋白激酶磷酸化或去磷酸化以影响精子形成、发育和精子活力。     

酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

利用GFP-Trap和酵母双杂交技术筛选TaPR1互作靶标

病程相关蛋白PR1(pathogenesis related PR1 proteins, PR1)在小麦抗病防御反应中发挥重要作用。本试验是在前期研究基础上,借助烟草成功表达TaPR1蛋白,利用GFP-Trap技术结合质谱分析获得与TaPR1互作的蛋白。同时,利用酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid, Y2H)在接种叶锈菌生理小种PHNT的‘中国春’小麦酵母文库中筛选获得与TaPR1互作的寄主蛋白。经过序列比对分析,2种方法共同筛选出谷氨酰氨合成酶(Glutamine synthetase)、细胞色素b6(Cytochrome b6)、应激蛋白(Stress protein)等可能与TaPR1互作的蛋白,为进一步深入研究TaPR1参与小麦叶锈病防御反应的分子机制提供了理论基础。     

利用酵母双杂交系统筛选玉米ZmPRR73的互作蛋白

为了阐明ZmPRR73基因的生物学功能,构建诱饵表达载体pGBKT7-ZmPRR73,利用酵母双杂交技术,从长日照光照环境诱导的热带玉米自交系的cDNA文库中筛选与ZmPRR73互作的蛋白。结果显示：构建的诱饵载体pGBKT7-ZmPRR73对酵母菌株无毒性,且对报告基因无自激活活性,共鉴定出12个与ZmPRR73互作的候选蛋白。生物信息学分析表明,这些候选互作蛋白的功能涉及植物的转录调控、离子跨膜转运的调节、信号转导、电子传递链等多个方面,推测ZmPRR73蛋白与以上蛋白互作参与多个信号转导和代谢途径,研究结果补充和完善了ZmPRR73蛋白参与的调控途径,为进一步研究生物钟核心元件ZmPRR73的分子功能提供了新的分子证据。     

通过酵母双杂交筛选水稻类受体激酶CR4的胞外结合蛋白

[目的]寻找CR4的胞外结合蛋白。[方法]采用OsCR4的胞外域作为诱饵蛋白,酵母双杂交筛选14 d的小苗cDNA文库。[结果]得到了许多蛋白,包括一个过氧化物B（D26484）、甲硫氨酸硫氧还原酶（ABF96078）和一个未知功能的蛋白。[结论]为研究CR4的信号转导机制提供了理论依据。     

利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子,在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒（RGSV）沉默抑制子P5互作的寄主蛋白,为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础,为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因,将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中,通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-LeuTrp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中,先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/...     

采用酵母双杂交系统筛选梨PbTMT4互作因子

为筛选梨糖转运相关蛋白PbTMT4互作因子,基于已经建立好的砀山酥梨果实发育时期的cDNA文库,利用Matchmaker~(TM) Gold酵母双杂交系统,以构建的重组质粒pDHB1-PbTMT4为诱饵质粒,采用PEG/LiAc法转化酵母菌株NMY51。利用表型筛选法检测PbTMT4的自激活作用和毒害作用,利用氨基酸缺陷型培养基筛选PbTMT4互作因子。结果表明,诱饵蛋白PbTMT4在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用。通过酵母双杂交筛选以及测序和序列比对分析,共获得13个与PbTMT4蛋白相互作用的宿主蛋白。     

通过酵母双杂交筛选水稻类受体激酶CR4的胞外结合蛋白（英文）

[目的]寻找CR4的胞外结合蛋白。[方法]采用OsCR4的胞外域作为诱饵蛋白,酵母双杂交筛选14d的小苗cDNA文库。[结果]得到了许多蛋白,包括1个过氧化物B（D26484）、甲硫氨酸硫氧还原酶（ABF96078）和1个未知功能的蛋白。[结论]为研究CR4的信号转导机制提供了理论依据。     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

利用酵母双杂交系统筛选猪Calsarcin-1基因相互作用蛋白

 【目的】利用酵母双杂交系统研究与猪Calsarcin-1相互作用的蛋白,了解Calsarcin-1在猪骨骼肌纤维类型形成和信号通路的调控功能。【方法】首先用长白猪Calsarcin-1基因构建既无自激活性又无毒性的pGBKT7-CS1诱饵载体;然后从猪的骨骼肌组织样中提取mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA;最后通过酵母双杂交系统的共转化法筛选与Calsarcin-1相互作用的蛋白,在GenBank中比对分析相互作用基因,分析Calsarcin-1在骨骼肌中的功能。【结果】构建了pGBKT7-CS1诱饵载体,获得具有完整3′端的猪骨骼肌单链cDNA,并合成双链cDNA。筛选出4个与Calsarcin-1相互作用的蛋白,经与人的基因比较分析,发现Calsarcin-1与α-1肌动蛋白和α-3辅肌动蛋白互作,与骨骼肌Z线附近结构形成有关;与肌集钙蛋白-1和肌钙蛋白T3互作,影响钙离子的调控。【结论】分析所筛选出的蛋白功能,推测Calsarcin-1通过结合这些蛋白,维持细胞结构的稳定,影响相关蛋白的钙离子结合能力,从而参与钙离子调控;而钙离子浓度的变化将影响到其它控制肌纤维分化的因子,或其它调控通路,共同调节快慢肌纤维的形成与转化。     

梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

【目的】筛选与FWL1互作的蛋白,为研究FWL1基因调节果实大小机理提供依据。【方法】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香为材料,提取4个梨品种果实细胞分裂关键时期的果肉组织混样RNA。构建梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库,并鉴定文库质量。构建诱饵载体并转化酵母菌,筛选与FWL1互作的蛋白,对初步筛选出的阳性酵母克隆进行测序并在NCBI中进行Blast比对,确定候选互作蛋白。【结果】文库库容约为3×10⁷ CFU,大于1×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 000 bp,阳性率为≥98%。诱饵载体无自激活功能,利用共转化方法,筛选出272个与FWL1互作的蛋白质。【结论】梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合酵母双杂文库的基本条件,适用于后期筛选相互作用的蛋白。筛选出的272个互作蛋白在果实发育过程中表达不同,其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

利用酵母双杂交筛选与苹果褪绿叶斑病毒CP互作的寄主因子

【目的】利用酵母双杂交系统筛选与苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）外壳蛋白（coat protein, CP）互作的寄主因子,利用生物信息学方法分析其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【方法】首先构建ACLSV CP的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold中,测定转化菌在SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上的生长情况,从而判断其在酵母双杂交过程中对报告基因的自激活活性。将pGBKT7-CP及pGBKT7分别转化至酵母菌株Y2H gold,培养不同时间后,用紫外分光光度计测定OD₆₀₀值,分析pGBKT7-CP对酵母菌生长的影响;然后通过顺序转化的方法自前期已构建好的苏俄苹果（Malus sylvestris cv. R12740-7A）cDNA文库中钓取与ACLSV CP互作的因子,最终在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选生长良好的蓝色阳性菌落,测定序列,并在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【结果】成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold后,转化菌只能在SD/-Trp平板上正常生长,不能在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上生长,表明重组质粒自身不能激活报告基因His及Ade的表达,没有自激活活性。酵母双杂诱饵载体pGBKT7-CP与对照空质粒转化菌生长情况相似,证明诱饵载体对酵母菌没有毒性;筛选到了69个互作寄主基因,包括转录因子活性、碳固定活性、细胞内铁离子平衡、防御反应、水解酶活性、氧化酶活性、氧化还原酶活性、光系统II组件、绑定蛋白等10类蛋白,经生物信息学分析,其中8个寄主基因（Malus3-1、Malus4-2、Malus4q1、Malus31-3、Malus49q2、Malus15-1、Malus6-2、Malus91-4）可能在病毒与寄主互作过程中起重要作用。【结论】分析筛选到的重要寄主蛋白功能,推测ACLSV CP与BZIP类、MYB类转录因子、病程相关蛋白（PR-5、PR-8、PR-10）互作,可能调控了寄主对病毒的抗性作用;与光系统II（PSII）的稳定性/装配因子蛋白、铁结合蛋白互作,影响植物光系统的稳定性及叶绿素的形成,从而降低光合作用。这将为揭示ACLSV导致寄主产生褪绿叶斑及树体衰退的原因提供理论依据。     

利用酵母双杂交系统筛选感病番茄中蔬四号与无毒蛋白AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白

 【目的】利用酵母双杂交系统在感病番茄中蔬四号中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,研究AvrPto、AvrPtoB作为毒性因子在感病番茄中的作用通路。【方法】提取感病番茄中蔬四号的总RNA,合成中蔬四号cDNA文库,分别构建AvrPto和AvrPtoB的诱饵载体,从中蔬四号cDNA文库中筛选分别与AvrPto、AvrPtoB互作的蛋白,并对阳性克隆进行分析和鉴定。【结果】最终筛选到7个与AvrPto互作的蛋白,2个与AvrPtoB互作的蛋白,核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）羧化酶/加氧酶小亚基和AvrPto、AvrPtoB都能够互作,说明AvrPto、AvrPtoB参与破坏植物的光合作用;另外与AvrPto互作的蛋白质还包括叶绿体原卟啉原氧化酶、叶绿体醛缩酶、叶绿体延伸因子TufA、翻译延伸因子等参与植物光合作用蛋白。【结论】分析筛选到的蛋白主要是参与植物光合作用的蛋白,推测AvrPto、AvrPtoB通过与植物光合作用有关的蛋白互作,或者影响卡尔文循环,或者影响叶绿素和相关蛋白质的合成,从而破坏植物光合作用,促进侵袭位点叶肉细胞衰老、死亡,进而引起坏死症状。     

水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达

水稻类受体蛋白激酶Os ESG1在种胚中特异表达,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Os ESG1基因全长c DNA经XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切,与同样经双酶切的原核表达载体p ET-28a(+)经T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21。原核表达结果显示,Os ESG1可受1 mmol/L IPTG诱导表达,且蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加,诱导7 h后,蛋白表达至较高水平。对不同浓度IPTG诱导下的蛋白表达情况进行研究,结果显示,0.1 mmol/L IPTG对Os ESG1的诱导表达效果最好。