牛源犬新孢子虫NcSAG1基因重组腺病毒株的构建及动物免疫试验

【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1™感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和Western blotting技术检测Ad5-NcSAG1及其表达蛋白产物。测定Ad5-NcSAG1重组腺病毒滴度后,接种Balb/c小鼠,测定小鼠血清中IgG特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4水平,以此评价重组腺病毒株的免疫应答效果。【结果】扩增的牛源犬新孢子虫NcSAG1基因大小为982bp,与GenBank中发表的NcSAG1（AF132217）核苷酸序列的同源性为99.2%;经PCR和Western blotting检测,重组腺病毒Ad5-NcSAG1在QBI-HEK 293细胞中包装成功,表达蛋白的分子量为33kD,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSAG1滴度为1010TCID50/mL,Ad5-NcSAG1接种Balb/c小鼠后,能够诱导产生高水平的IgG特异性抗体和IFN-γ、IL-4细胞因子。说明Ad5-NcSAG1重组腺病毒对Balb/c小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答。【结论】成功构建了牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,该毒株能够诱导Balb/c小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,为犬新孢子虫新型疫苗的临床试验奠定了基础。     

猪圆环病毒2型不同分离株体内增殖特性的研究（英文）

【目的】探讨PCV2感染后血清和组织中病毒含量的动态变化以及不同PCV2毒株间的差异。【方法】建立了快速、敏感和特异的用于检测猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR方法。以200μL 1×10~6TCID_(50)/mL的猪圆环病毒2型不同分离株攻毒Balb/c小鼠,于不同时间采集感染后血清和组织,利用SYBR Green I荧光定量PCR进行病毒含量的测定。【结果】结果表明,该Real-time PCR能够检测出PCV2,具有较高的特异性。利用该方法对不同毒株攻毒后的Balb/c小鼠进行检测,结果显示攻毒后14天均可以在小鼠的血清中检测到PCV2,2007HA株(PCV2c)最高,达1.21×10~8拷贝/mL;21天时均降低;攻毒后28天又有上升趋势,2010NJ(PCV2b)最高。肺脏和脾脏的检测结果表明,2010NJ和2009ZJ两株PCV2b分离株的脏器病毒含量最高。【结论】PCV2不同分离株在Balb/c小鼠中增殖效率是不同的,且2009ZJ株在脏器中的增殖率明显高于血清,其他毒株则不明显,这也为分析PCV2不同毒株的体内增殖特性和致病性奠定基础。     

多杀性巴氏杆菌强毒株对雏鸭的致病性研究

【目的】探讨鸭源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)强毒株对雏鸭的致病性。【方法】以口服灭菌生理盐水的雏鸭为对照,通过口服和滴鼻接种途径将PM人工感染雏鸭,观察雏鸭的发病情况;于接种后不同时间内随机剖杀试验组和对照组雏鸭,采集肝脏、肺、心脏和脾脏、胸腺、腺胃和小肠等组织,常规方法制备石蜡切片,进行H.E.染色,观察各器官组织学变化;利用建立的间接免疫荧光法对PM在雏鸭体内的分布进行研究。【结果】接种PM后,引起雏鸭出现精神不振,呼吸困难,腹泻等症状;剖检病变以心包积液、肺出血和肝脏点状坏死为特征。PM动态增殖检测结果表明:滴鼻接种后12h,肺中PM含量最高,达到4.47×103 CFU/g,而口服接种后12h,胸腺中PM含量最高,达到5.12×103 CFU/g;2种途径接种PM后18～30h均以雏鸭胸腺PM含量最高。病理组织学变化以肺脏充血、出血,肝脏脂肪变性,脾索紊乱等为特征;荧光阳性信号主要分布于肺、肝脏、胸腺和脾脏等器官。【结论】PM感染主要引起雏鸭的出血、败血性变化;滴鼻接种PM对鸭的致病力明显高于口服接种;胸腺、肺、肝脏和脾脏是PM侵害的主要靶器官。     

不同Ⅱd亚型微小隐孢子虫对BALB/c小鼠的感染性

为比较微小隐孢子虫不同亚型对小鼠的感染性,分别从河南和宁夏的犊牛体内获得两株微小隐孢子虫,利用分子方法进行基因亚型鉴定后,分别感染提前免疫抑制的3~6周的BALB/c小鼠,对感染前后小鼠粪样进行显微观察和PCR检测。结果显示,2个微小隐孢子虫分离株的亚型分别为ⅡdA19G1和ⅡdA15G2R1;2个亚型均可感染BALB/c小鼠,其中ⅡdA15G2R1感染小鼠后2d和3d可在显微镜下观察到卵囊,而感染ⅡdA19G1的小鼠在任何时间均未在显微镜下观察到卵囊;PCR检测发现2个亚型的小鼠排卵囊周期分别为18d和20d。该研究结果为微小隐孢子虫感染小鼠模型的建立提供一定理论依据。     

白细胞介素-10分子佐剂增强口蹄疫DNA疫苗黏膜免疫效果研究

 【目的】研究白细胞介素-10作为黏膜分子佐剂是否可以增强口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）的黏膜免疫应答。【方法】利用RT-PCR技术以Balb/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,扩增出小鼠的IL-10基因,并构建真核表达质粒proVAX-IL-10, 通过鼻腔接种方式,将口蹄疫DNA疫苗（pcD-VP1）和真核表达质粒（proVAX-IL-10）共同免疫小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠黏膜部位（肺脏、生殖道）sIgA滴度,免疫组织化学法检测气管、生殖道和小肠中sIgA 的表达情况,CSFE染色法检测小鼠扁桃体淋巴细胞增殖反应水平,用胞内细胞因子染色法通过流式细胞仪检测扁桃体部位CD4+阳性T细胞内IFN-γ和IL-4的表达量。【结果】成功构建了proVAX-IL-10真核重组质粒,且重组质粒可以在BHK细胞中有效表达;将proVAX-IL-10与口蹄疫DNA疫苗pcD-VP1共同免疫小鼠后发现,与单独接种pcD-VP1相比,加入IL-10分子佐剂后,可以诱导更高水平的黏膜sIgA的表达及分泌,极大的提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应水平以及CD4+ T细胞中IL-4的表达量。【结论】IL-10作为分子佐剂,通过鼻腔黏膜免疫后,可以有效增强机体对口蹄疫DNA疫苗的黏膜免疫应答,对于预防口蹄疫病毒的感染和清除体内病毒起到重要的作用。     

鸭瘟病毒对SPF鸭的致病性研究

【目的】探讨鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）对SPF鸭的致病性。【方法】将DPV分别通过点眼滴鼻和皮下注射接种途径人工感染SPF鸭,以未攻毒健康SPF鸭为对照,观察各组鸭的发病情况及症状,于感染后不同时间随机剖杀试验组和对照组SPF鸭,采集肝脏、脾脏、肾脏、肺、心脏、气管、食道、肠道、胸腺、法氏囊、脑和泄殖腔等组织,常规方法制备石蜡切片,HE染色,观察各器官病理组织学变化,同时利用间接免疫荧光染色法（IFA）对DPV抗原在鸭体内的分布进行检测,并进行血常规和血液生化指标检测,分析了DPV对SPF鸭淋巴细胞转化率的影响。【结果】DPV接种后,引起鸭高热、下痢,组织器官出血、坏死,食道、泄殖腔黏膜出血、溃疡并有灰黄色假膜覆盖;病理组织学变化以血管壁损伤为主,肝、脾细胞变性、坏死,消化道黏膜上皮细胞坏死脱落。DPV感染后,在鸭的脾脏、胸腺、法氏囊、肝脏、食道、泄殖腔、肠道、肾脏、肺及气管中均检测到DPV抗原,且以肝脏、脾脏等组织中荧光最强;在脑和心脏中均未检测到DPV抗原。DPV感染组鸭血清中白细胞总数（WBC）、红细胞总数（RBC）、血小板总数（PLT）和总蛋白（TP）、血红蛋白（HGB）含量及丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、淋巴细胞转化率与对照组差异大多达显著或极显著水平。【结论】DPV感染主要引起SPF鸭各组织器官广泛性出血;脾脏、胸腺、法氏囊等免疫器官首先受到攻击和损害,并造成免疫抑制;皮下注射接种DPV比点眼滴鼻接种对SPF鸭的致病性强。     

MTB感染对小鼠肺脏上皮细胞NF-κB和p53信号通路的调控

【目的】探讨在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染小鼠早期,其肺脏上皮细胞中NF-κB和p53信号通路参与机体的免疫调控作用。【方法】将C57BL/6 Cnc小鼠30只(雄、雌各15只),按5只/组设空白对照组、阴性对照组(腹腔注射生理盐水)和MTB感染组(腹腔注射牛结核分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)),感染4 d后经安乐死处死小鼠,摘取小鼠肺脏和脾脏进行形态学观察;将小鼠肺脏进行冰冻超薄切片,HE染色分析其肺脏病理变化;利用免疫组织荧光技术和激光共聚焦显微镜,标记SP-C阳性肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的位置,观察NF-κB和p53蛋白在肺泡上皮细胞中的表达情况。提取小鼠肺脏组织细胞总蛋白,以β-actin为内参,通过Western blot分析NF-κB和p53信号通路相关因子TLR4、TRAF6、NF-κB、p53、MDM2和CBP在蛋白水平上的变化。【结果】在MTB感染小鼠4 d后,小鼠肺脏形态无明显变化,脾脏1/3尖部瘀血变黑;HE染色发现肺脏组织炎性细胞浸润。在小鼠肺脏上皮细胞中NF-κB与p53蛋白免疫荧光表达较空白对照组和阴性对照组增强。TLR4、NF-κB、p53、MDM2和CBP蛋白在雄性与雌性小鼠中都呈现出显著上调。【结论】当结核分枝杆菌感染小鼠时,小鼠肺脏上皮细胞通过NF-κB和p53信号通路活化来参与宿主抗结核分枝杆菌病感染的免疫调控作用。     

实时定量PCR探讨猪细小病毒自然感染猪体内病毒的分布情况

【目的】探讨猪自然感染猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)后病毒在体内的分布情况,分析病毒对猪器官组织的嗜性,揭示猪细小病毒的致病机制。【方法】利用已建立的猪细小病毒SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,定量检测自然感染仔猪、妊娠母猪和同时混合感染有猪圆环病毒2型的仔猪器官组织中PPVDNA的相对含量,分析猪细小病毒的组织嗜性及其与圆环病毒混合感染时的相互作用机制。【结果】在多种器官组织中均可检测到PPV,在感染仔猪的肾脏、脾脏、髂下淋巴结中病毒含量较高,为1.39×105～1.81×106μL-1;在感染妊娠母猪的肾脏、脾脏、肺脏、子宫内膜中病毒含量为4.56×105～5.82×106μL-1;混合感染PPV和猪圆环病毒2型(PCV2)仔猪肺脏中的PPV DNA相对含量显著增加,从2.69×104μL-1增加到5.04×105μL-1。【结论】PPV对猪肾脏、脾脏、淋巴结、妊娠母猪子宫的嗜性最强,对肝脏的嗜性较弱;PCV2的混合感染可促进PPV在肺脏的复制增殖,增强了PPV对感染器官组织的亲嗜能力。     

五味子甲素在小鼠体内组织的分布特点及其靶向疗效研究

【目的】建立小鼠组织中五味子甲素的质量浓度测定方法,并研究五味子甲素在小鼠体内的组织分布及其靶向治疗效果。【方法】将五味子甲素按25mg/kg一次灌胃ICR雄性小鼠,于给药后0.5,1,2,3和4h分别取小鼠心、肝、肾、脑,用生理盐水洗净后制成0.25g/mL组织匀浆,以睾丸酮为内标物,采用高效液相色谱法(HPLC)测定五味子甲素在小鼠心、肝、肾、脑中的质量浓度,并对HPLC方法的专属性、回收率、精密度和稳定性进行考察。依据五味子甲素在各组织中的峰值及各时间段的质量浓度,确定其分布最高的组织,对质量浓度分布最高的组织进行相关的药理学评价。【结果】小鼠心、肝、肾、脑组织中五味子甲素质量浓度为0.625~20μg/mL时,其质量浓度与五味子甲素/内标峰面积线性关系良好(r≥0.999 0)。HPLC法的专属性良好;日内精密度为(3.15±0.82)%~(4.77±0.57)%,日间精密度为(5.51±1.82)%~(8.46±2.93)%;稳定性试验的RSD10%;绝对回收率为(89.04±3.82)%~(91.37±3.77)%,相对回收率为(95.65±5.76)%~(106.07±8.29)%。五味子甲素1次灌胃给药(剂量25mg/kg)后在小鼠体内心、肝、肾、脑组织中均有分布,给药1h后五味子甲素在小鼠心脏、脑组织中质量浓度达到峰值,给药2h后在小鼠肝脏和肾脏中质量浓度达到峰值。整个分布情况显示,给药后1,2,3h五味子甲素在小鼠肝脏组织中的质量浓度均高于其他组织,且达峰值时其质量浓度也显著高于心脏、肾脏、脑(P0.05);其次是肾脏,五味子甲素质量浓度较低的为心脏和脑。五味子甲素对CCl4所致的小鼠急性肝损伤确有一定的保护作用。【结论】该测定方法简便、快速、稳定,可用于小鼠内脏组织中五味子甲素质量浓度的测定;小鼠灌胃给药后五味子甲素在小鼠体内心、肝、肾、脑组织中均有分布,且达峰值时以肝脏中质量浓度最高,其次是肾脏,心脏与脑中较低;五味子甲素对CCl4所致的小鼠急性肝损伤有一定保护作用。     

兔出血症病毒在小鼠体内分布及免疫试验

应用纯化兔出血症病毒(RHDV)接种小鼠3d后剖杀,分离组织,通过电镜观察、血凝试验(HA)、RT-PCR,进行体内分布检测;同时将小鼠接种3次后10 d,分离脾淋巴细胞进行IFN-γ、IL-2、IL-4、WST检测.电镜观察未见到病毒粒子;HA检测结果为肝脏的HA价最高,肺脏最低;RT-PCR未检测到目的基因;WST检测结果表明,免疫组刺激指数高于对照组;免疫组的IFN-γ和IL-2检测指数高对照组;IL-4检测结果低于对照组.RHDV接种小鼠分离的肝脏具有血凝性,能产生良好的细胞免疫反应.     

奶牛流产病因探究及新孢子虫病PCR检测方法的建立

[目的]探究新疆某奶牛场奶牛流产病因.[方法]采集的19份血清样品和4份牛流产胎儿脑组织进行布氏杆菌病凝集实验、弓形虫PCR检测和新孢子虫病ELISA方法检测,参考GenBank登录的犬新孢子虫种Nc-5序列[1],设计引物,建立新孢子虫病的PCR检测方法.[结果]调查结果显示该牛场布氏杆菌病与弓形虫病感染均呈阴性,新孢子虫病感染率为14.3;(2/19).新孢子虫PCR诊断方法的最佳退火温度为57℃,灵敏度为35 pg/μL.用建立后的PCR方法检测流产胎儿,感染率为50.0;(2/4).[结论]新孢子虫病是导致该厂奶牛流产的重要原因之一,为今后新疆地区有效预防和治疗新孢子虫病提供了一定的科学依据.     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失株的构建

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素（cat）选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H（△IMPDH）对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H（△IMPDH））对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108 CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108 CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H（△IMPDH）,并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。     

H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸变异分析

【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后,能够稳定的在豚鼠间传播,可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此,使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN,应用小鼠动物模型,研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力,以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点,探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010（H9N2）在小鼠的肺脏进行传代,将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠,传播九代后,用MDCK细胞扩繁病毒,得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1;扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序,推断各基因编码的氨基酸,与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对,得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点;解剖小鼠,获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠,滴定各组织中的病毒滴度,检测病毒的组织噬性;乙醚麻醉小鼠后,每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠,检测小鼠的幸存率和发病率;采集攻毒小鼠的肺部,固定后进行病理切片和免疫组化,比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,其MLD₅₀为10^3.5EID₅₀,10⁶EID₅₀、10⁵EID₅₀、10⁴EID₅₀攻毒剂量的小鼠幸存率是0,而原毒JN对小鼠不致死,JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1 000倍;攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为10⁶-10³EID₅₀的小鼠,体重明显减少,临床症状也很明显,攻毒后3-8 d,小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状,而原毒JN在10⁶EID₅₀时,小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似;JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同,都是只能特异性结合SAa-2,6Gal受体,具有人样流感病毒的受体结合特性;JN病毒仅能在小鼠肺部检测到,病毒滴度很高,而JN-P9-2-M1不仅在小鼠肺部有很高的滴度,在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑部都能检测到。【结论】 JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高,比原毒提高了至少1 000倍;PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因,而PA L342I和NA N218T这两个点突变,就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。     

H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的,笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行HA基因替换以后,病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点,为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】 对ZD71和SY130的HA蛋白氨基酸序列进行比对,确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物,构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID₅₀）。将拯救的亲本病毒、HA单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞,测定病毒的体外复制能力;将上述各株病毒以50 μL含10⁶EID₅₀的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠,分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器,匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况;将病毒分别以50 μL含10¹-10⁶EID₅₀的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠,感染后每天称量小鼠体重,当小鼠体重下降比率超过25% 时判定为死亡,统计死亡情况,测定病毒的小鼠半数致死量（MLD₅₀）,评估各突变病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒进行分析比较后,获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒HA蛋白共存在4个氨基酸差异位点,分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认,分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况,结果发现与亲本病毒rZD71相比较,突变病毒rZD71-HA/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后,复制滴度均显著提高;与rSY130相比较,突变病毒rSY130-HA/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后,复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现HA 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性,与亲本病毒rZD71相比,225位氨基酸由G突变为E后,病毒rZD71-HA/G225E的MLD₅₀由4.32 log₁₀EID₅₀降低至3.0 log₁₀EID₅₀;病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到,而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】 HA蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用,提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况,为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。     

3株广西麻雀源H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡的致病性

【目的】明确麻雀源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对鸡群的致病性,既有利于了解麻雀在H9N2亚型AIV传播生态链中的作用,对科学防控H9N2亚型AIV的暴发流行也具有重要意义。【方法】选取3株HA基因处于不同进化分支的广西麻雀源H9N2亚型AIV进行SPF鸡致病性试验,将84羽4周龄SPF鸡随机均分为4组(空白对照组和3个感染组)。感染组每组以100μL稀释至106EID₅₀/100μL的病毒液经鼻腔感染16羽SPF鸡,于病毒感染24 h后分别在各感染组放入剩余的5羽SPF鸡作为空白接触组,感染后观察鸡群的临床症状及剖检病理变化,在不同时间点采集器官组织制作病理切片并检测不同器官中的病毒滴度及分布情况。【结果】3株麻雀源H9N2亚型AIV在HA蛋白裂解位点处不存在多个碱性氨基酸插入现象,表现为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV(LPAIV)的典型分子特征;对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)在10-6.0/0.2 mL~10-6.8/0.2 mL,半数致死量(ELD₅₀)在10-6.8/0.2 mL~10-7.2/0.2 mL。3株H9N2亚型AIV均可直接感染SPF鸡,且病毒在不同器官中的滴度及分布存在一定差异;感染SPF鸡后均未表现出明显的临床症状和死亡现象,但在上呼吸道的气管及肺脏出现一定程度的充血和出血、气管纤毛脱落及炎性淋巴细胞浸润等病变。3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒期主要介于第1~7 d,且能不经体内适应而直接感染鸡群并排毒;3株麻雀源H9N2亚型AIV在SPF鸡各器官中的复制能力存在一定差异,可在气管和肺脏中进行有效复制,而在肝脏、脑、胰腺、胸腺、心脏、盲肠扁桃体及法氏囊中均未检测到对应的病毒。【结论】麻雀源H9N2亚型AIV可直接感染鸡群且具有在鸡群间水平传播的潜在风险,提示在家禽饲养、运输及销售等环节要做好相关的防护措施,切断AIV在野鸟与家禽间的传播途径,减少禽流感暴发造成的经济损失。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

【目的】 表达欧亚类禽型（eurasian avian-like,EA）H1N1猪流感病毒（SIV）的血凝素（HA）蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】 利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光（IFA）检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100 μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠（I组和II组）,间隔3周后进行加强免疫（二免）;同等数量的小鼠以相同方式注射100 μL无菌PBS作为非免疫对照组（III组和IV组）。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制（HI）试验和病毒中和（VN）试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠（I组和III组）用50 μL（10 ^6.0EID₅₀）的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组（II组和IV组）用A/swine/Heilongjiang/44/2009（H1N1）（HLJ44）病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3 天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。 【结果】 经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒pCAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。10 ^6.0EID₅₀的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;10 ^6.0EID₅₀的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低（P<0.0001、P <0.001、P <0.05）。 【结论】 重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒 pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究#br#

【目的】克隆、表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7转位紧密素受体(Tir)基因,并研究其抗原性。【方法】选用pET28原核表达载体,体外构建Tir原核表达重组菌,并在大肠杆菌中获得高效表达。选用家兔制备高滴度多克隆抗体,Western blot分析其免疫原性。选用HEp-2细胞进行粘附和粘附抑制试验,通过光镜、电镜和荧光显微镜进行观察。选用Balb/c小鼠进行免疫试验。【结果】成功获得高效表达重组Tir蛋白,并制备了兔源Tir多克隆抗体,Western blot分析此抗体能与Tir发生特异性抗原抗体反应。表达Tir蛋白能够抑制O157:H7对HEp-2细胞的粘附和A/E损伤。二免后Balb/c小鼠保护率高达75%以上。【结论】在大肠杆菌中成功克隆表达了Tir基因,所获重组Tir蛋白具有良好的抗原性,可能用于肠出血性大肠杆菌O157基因工程疫苗的研究。