应用正交试验法优选茎瘤芥高效遗传转化体系

[目的]建立茎瘤芥高效遗传转化体系,为茎瘤芥及芸薹属植物遗传转化奠定基础。[方法]应用正交试验法研究茎瘤芥遗传转化过程中预培养时间、共培养时间、侵染液浓度、侵染时间、对转化率的影响。[结果]最适合茎瘤芥CRY2基因RNAi载体遗传转化的条件为预培养3 d、共培养4 d、侵染液浓度OD600=0.5、侵染10 min,此时Kana选择压为30 mg/L。[结论]优选出了农杆菌转化的最宜条件,遗传转化率有较大提高。     

Cry2A基因植物表达载体构建及其转化子生长曲线的建立

根据定向克隆原则,以pCAMBIA2301为载体骨架,Cry2A基因为目的基因,构建了大小为15354 bp的植物表达载体p2AST2301。新载体带有抗虫基因Cry2A和筛选标记基因NPTⅡ,适合通过农杆菌进行遗传转化,并以抗生素G418为筛选底物。同时将新载体转化根癌农杆菌EHA105,获得了用于植物遗传转化的工程菌,并且明确了工程菌D600 nm值在1.0-1.6之间活力最强。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

应用正交试验优选茎瘤芥子叶组培诱导培养基

[目的]建立茎瘤芥体细胞培养再生植株体系,为芸薹属植物茎瘤芥及芥菜的遗传转化体系及生物技术育种奠定基础。[方法]以茎瘤芥6 d苗龄子叶为材料,应用正交试验法研究不同浓度生长激素6-BA、NAA、2,4-D对外植体分化和愈伤组织成苗率的影响。[结果]最适合茎瘤芥外植体分化成苗的培养基为MS加6-BA 3.0 mg/L＋NAA 0.10 mg/L＋2,4-D 0 mg/L＋3 g/L琼脂粉;1/2MS＋0.10mg/LNAA利于组培苗生根。[结论]优选培养基的再生频率具有较大提高。     

茎瘤芥PHYA基因与茎瘤芥茎膨大关系的初步研究

从茎瘤芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物超表达载体,通过农杆菌GV3101转化茎瘤芥——永安小叶,得到PCR反应呈阳性的转基因株系.结果发现,在自然生长环境下,转基因植株发生了多种形态变异,如植株矮化、花期提前、叶片变大且色泽浓绿、转基因植株茎膨大延缓等.初步推断PHYA基因参与调控茎瘤芥植物茎膨大过程,过量表达PHYA基因可能会抑制茎膨大过程.     

发根农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系的建立

[目的]建立新的橡胶树遗传转化体系,为利用基因工程技术研究橡胶树提供基础。[方法]利用发根农杆菌R1601、15834和1.2556 3个株系分别侵染橡胶树热研7-33-97的叶片和茎段,诱导毛状根,并利用PCR技术检测诱导得到的毛状根。[结果]在相同的条件下,仅橡胶树茎段在发根农杆菌R1601侵染后产生毛状根,其诱导率达36.6%;PCR结果表明,T-DNA序列已整合进橡胶树的基因组中。[结论]初步建立了发根农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系。     

发根农杆菌介导芸芥的遗传转化及其次生代谢物的研究

[目的]研究发根农杆菌介导芸芥的遗传转化条件,并测定次生代谢物的含量。[方法]通过发根农杆菌R1000介导的遗传转化,建立芸芥发状根的诱导和培养体系,采用氯化钯分光光度法和高效液相色谱法对该发根培养物合成硫苷的能力进行初步分析,并分析乙酰丁香酮（As）、浸染液pH值和浸染时间等因素对发状根转化频率的影响。[结果]子叶的转化率明显高于下胚轴;AS最佳浓度为100mg／L,浸染液最佳pH值为5．4,最佳浸染时间为20min。PCR的鉴定结果表明,发根农杆菌R1000的rolB基因已成功地转入并整合到该发根培养物的基因组中。[结论]该方法建立了芸芥发状根培养体系,并初步分析了该发状根中硫苷的含量,为以后的研究奠定了一定的基础。     

葡萄高效再生体系的建立及转LEAFY基因的研究靠

采用葡萄茎段为外植体建立起高频再生体系,随后建立了农杆菌介导的葡萄主栽品种玫瑰香的稳定遗传转化体系,获得了转基因植株.将携带拟南芥菜LEAFy基因的pDC202载体转化到农杆菌菌株GV3103中,与茎段共培养3 d后,在附加利福平的培养基GS+ZT(2.0mg/L)上选择培养4周.经压力选择培养初步筛选到转基因植株,且可以直接获得生根转化试管苗;从初步鉴定的转化植株上选取壮幼嫩的新叶作为材料,提取葡萄基因组DNA,借助PCR、Southern杂交等分子生物学手段进一步鉴定,结果表明LEAFy基因已成功整合到葡萄染色体DNA上,且转化频率较高.     

葡萄高效再生体系的建立及转LEAFY基因的研究

采用葡萄茎段为外植体建立起高频再生体系,随后建立了农杆菌介导的葡萄主栽品种玫瑰香的稳定遗传转化体系,获得了转基因植株.将携带拟南芥菜LEAFy基因的pDC202载体转化到农杆菌菌株GV3103中,与茎段共培养3 d后,在附加利福平的培养基GS+ZT(2.0mg/L)上选择培养4周.经压力选择培养初步筛选到转基因植株,且可以直接获得生根转化试管苗;从初步鉴定的转化植株上选取壮幼嫩的新叶作为材料,提取葡萄基因组DNA,借助PCR、Southern杂交等分子生物学手段进一步鉴定,结果表明LEAFy基因已成功整合到葡萄染色体DNA上,且转化频率较高.     

根癌农杆菌介导欧美杨108遗传转化体系的优化

[目的]优化根癌农杆菌介导的欧美杨108遗传转化体系。[方法]以欧美杨108无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行优化研究。[结果]试验获得的优化转化体系如下:农杆菌介导欧美杨108遗传转化的潮霉素最佳叶片分化浓度为2mg/L,生根浓度为1 mg/L。优化筛选的最适转化条件为:预培养48 h,菌液浓度OD600为0.4,侵染15 min,共培养48 h。试验共获得18个抗性愈伤和抗性芽,转化频率为4.3%;经PCR检测初步证明TCS基因已整合至欧美杨108再生植株中。[结论]该研究建立了高效欧美杨108叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

【目的】克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体，为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备。【方法】以抗草甘膦大豆总基因组为模板，扩增EPSPS基因，构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS，并导入农杆菌，使其能够进行作物的遗传转化。【结果】扩增获得EPSPS基因全长1368 bp，共编码455个氨基酸。测序结果表明，其与GenBank（AF464188.1）中已知的CDS序列完全一致，成功构建了EPSPS植物表达载体，并将其导入农杆菌菌株EHA105中。【结论】构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良。     

农杆菌介导的中华补血草遗传转化体系的建立

[目的]为利用转基因技术培育中华补血草新品种奠定基础。[方法]对农杆菌介导的中华补血草转化体系中的各种影响因素进行了系统研究,以构建中华补血草的遗传转化体系。[结果]中华补血草叶片对卡那霉素敏感,以50 mg/L卡那霉素作为补血草叶片转化受体较为适宜。400 mg/L特美汀能有效抑制农杆菌,而500 mg/L头孢曲松钠则不能。菌株EHA105对中华补血草的转化率达15%,远高于菌株LBA4404和GV3101。对于侵染中华补血草无菌苗叶片的重悬菌液,以OD600为0.7~1.0为宜。4 d共培养的效果较好,15.6%外植体可分化成芽。PCR检测结果表明30株卡那霉素抗性植株均为阳性,而阴性对照未扩增到条带,表明NPTⅡ外源基因已整合到受体植物基因组中。[结论]影响中华补血草转化率的关键因素是农杆菌菌株的选择。     

超重处理对茎瘤芥种子萌发及幼苗生长的影响

[目的]研究超重处理对茎瘤芥(Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee)种子萌发及幼苗生长的影响,探讨超重处理对茎瘤芥种子生长发育的影响机理。[方法]以0、2 000、3 000和4 000 r/min的超重力分别处理茎瘤芥种子1.5、3.0和4.5 h后,进行培养,观察其出苗时间、出苗率、性状表现,并测定幼苗叶绿素含量、可溶性蛋白含量和过氧化物酶活性。[结果]与对照相比,超重处理后,茎瘤芥发芽率、发芽势和发芽指数随处理条件变化有不同程度的降低。超重处理后,苗期茎瘤芥植株变矮,根系变短且发达,叶长变短,鲜重和干重都有不同程度的降低,而茎粗则不同程度增加。超重处理后,茎瘤芥幼苗叶绿素含量和过氧化物酶活性都有不同程度的增加,而可溶性蛋白含量有不同程度的降低。超重处理可以影响茎瘤芥幼苗的生长,处理时间以及重力加速度是影响其生长的重要因素,适当的超重处理可以促进植物生长。同时,超重处理可增强茎瘤芥幼苗的抗倒伏能力、抗有害物的能力和合成有机物的能力。[结论]该研究可为超重技术在茎瘤芥生产中的应用提供参考依据。     

番茄cry1基因果实特异性植物表达-载体的构建及其转化番茄的研究

隐花色素(cryptochrome)是一类对UV-A/蓝光作出应答的光受体.果实特异性植物表达载体是用在番茄果实中特异表达的Lefsm1基因的启动子(fsp)替换质粒pBI121原有的35S启动子构建而成(称为pBI121 fsp).将番茄隐花色素家族成员之一cryptochrome1中465 bp特异片段导入到植物栽体pBI121 fsp构建成果实特异性表达的RNAi植物表达载体(pBlI21fsp-cryI),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养成功获得转基因植株.为后续对CRY1与番茄果实中抗氧化剂番茄红素之间的关系研究提供了材料.     

苜蓿植株再生和农杆菌遗传转化条件的研究

[目的]建立苜蓿植株再生体系和农杆菌遗传转化体系。[方法]以"猎人河"苜蓿品种为受体材料,对影响苜蓿植株再生和遗传转化的相关因素进行了研究。[结果]最佳愈伤诱导培养基为改良SH+4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA,最佳继代培养基为MSO+0.5mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3,而最佳分化培养基为MS,苜蓿植株再生的最佳外植体是下胚轴。苜蓿农杆菌遗传转化的选择压确定为60 mg/L卡那霉素(Kan),最适宜的抗菌素为350 mg/L羧苄青霉素(Carb),农杆菌菌液的最适OD600为0.6,最佳侵染时间为10 min。[结论]该研究为今后苜蓿的基因工程研究奠定了基础。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

颠茄H6H基因的克隆及高效植物表达载体的构建（摘要）

[目的]克隆颠茄（Atropa belladonna）H6H基因并构建高效植物表达载体。[方法]采用RT-PCR方法从颠茄（Atropa belladonna）中克隆莨菪碱-6β-羟化酶和1,4-丁二胺-氮-甲基转移酶基因编码区,插入经改造后获得双元三价植物高效表达载体p2301-gus,构建植物表达载体p2301-H6H,并将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404和发根农杆菌C58C1。[结果]获得了可直接用于遗传改良的颠茄工程菌p2301-H6H-LBA4404和p2301-H6H-C58C1。     

甘蓝型油菜透明种皮12（TT12）基因家族反义抑制植物表达载体的构建

【研究目的】构建一个同时反义共抑制甘蓝型油菜(Brassica napus)透明种皮12基因家族(BnTT12)转录的植物表达载体。【方法】通过PCR扩增得到BnTT12家族一段503bp的特异保守片段TT12A,通过亚克隆整合到中间载体pCambia2301G,构建TT12反义植物表达载体pCambi-a2301G-TT12A。采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌。【结果】经过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成TT12反义表达载体的工程菌株。【结论】pCambia2301G-TT12A的成功构建为利用此反义载体通过遗传转化获得转基因新型黄籽油菜和进一步探明TT12基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理奠定了基础。