甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC57质粒中测序后,用EcoR I和Not I双酶切,连接到pPIC9k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His^ Mut^ 重组子。0．5％甲醇诱导表达96h后,对发酵液和细胞进行SDS—PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6．0kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符。用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329mg／L。     

甜味蛋白Brazzein基因酵母表达系统的建立

根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。     

鸡γ干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效分泌表达ChIFNγ的重组毕赤酵母菌株,利用基因工程技术,将435 bp的ChIFNγ成熟肽编码基因亚克隆到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体PPICZαC中,将该重组质粒用BstX Ⅰ线性化并通过电击法转化毕赤酵母X-33菌株,用500 μ/mL抗生素Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌.甲醇诱导表达的重组ChIFNγ经SDS-PAGE电泳,可在相对分子质量约2.0×104处检测到目的蛋白带,目的蛋白占酵母表达上清液总蛋白质的35％.微量细胞病变抑制法检测表达产物的生物学活性,检测结果表明,巴斯德毕赤酵母表达的重组ChIFNγ的抗病毒效价为6 400 U/mL.     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆载体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用Sal I线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31kD的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

Brazzein基因的合成及pGAPZαA-Bra表达载体的构建

[目的]为Brazzein基因在酵母SMD1168中转化和表达奠定基础。[方法]利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)合成Brazzein基因,将其连接到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-Bra。分别用XhoI和XbaI限制内切酶对克隆质粒pMD18-T-Bra和酵母表达载体pGAPZαA进行酶切,并在T4DNA连接酶作用下,将回收的目的基因连接到pGAPZαA载体上,构建重组质粒pGAPZαA-Bra。[结果]通过PCR扩增获得了约188 bp的Brazzein类似物的编码序列,将其克隆到pMD18-T质粒,用XhoI和XbaI双酶切后,连接到pGAPZαA载体,成功构建了重组表达载体pGAPZαA-Bra。Brazzein基因其中各碱基未发生突变,整个表达载体阅读框正确无误。[结论]利用基因工程的方法生产Brazzein是可行的。     

毕赤酵母植酸酶基因工程菌高密度培养及诱导表达

研究了毕赤酵母基因工程菌高密度发酵培养方式和植酸酶基因高效表达策略.采用逐步增加流加方式进行高密度培养,结果发酵液中细胞干重达到64g/L.通过在线检测细胞消耗甲醇的MSUR,估算细胞在单位时间内对甲醇需求量,从而确定甲醇流加速率,采用此种方法可使重组毕赤酵母高水平表达植酸酶,最终发酵上清液中总蛋白量为8.58 g/L,植酸酶活力达到853 U/mL.     

酸性植酸酶phyB在毕赤酵母GS115中的表达

通过PCR方法扩增得到无信号肽无内含子的酸性植酸酶phyB基因,将此基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并转化毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组毕赤酵母.在甲醇的诱导下,该植酸酶phyB基因在毕赤酵母中得到表达.经SDS-PAGE凝胶电泳分析,该重组蛋白的相对分子质量为7.5×104,而该植酸酶在大肠杆菌DH5α表达系统中表达的相对分子质量为6.0×104,这可能是由于糖基化的结果.酶学性质检测发现,表达的植酸酶最适作用温度为65℃,比野生原始菌株的提高了10℃;诱导pH值为5.5时,蛋白的表达量最高,为10 528.6 U/mL,是野生菌株的2.8倍;最适作用pH值为2.5;在70℃条件下处理60 min,该酶的相对酶活力为40%,在75℃时处理10 min,该酶的相对酶活力为10%.     

来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

 应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106I     

功能性猪α干扰素基因的表达及活性检测

[目的]检测克隆猪α干扰素基因（IFN-α基因）在毕赤酵母中的表达。[方法]经植物血凝素（PHA）诱导后,提取猪外周血淋巴细胞,并用RT-PCR方法获得IFN-α基因,将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接,并电转入毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测IFN-α蛋白表达,Western-blot分析IFN-α蛋白活性。[结果]重组转化菌株经甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19kD的蛋白质,该蛋白质能与相应抗体产生免疫反应。[结论]实现了猪功能性IFN-α基因表在毕赤酵母中表达,为进一步探讨IFN-α的生物学活性研究奠定了基础。     

pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.