拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

[目的]探索基于AFLP的拮抗链霉菌DNA模板制备方法及其扩增体系，为AFLP技术在链霉菌乃至放线菌资源分析中的应用提供依据。[方法]以改进的CTAB法提取DNA，利用Pst I／Mse I型AFLP试剂盒及其反应体系进行扩增，采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增结果。[结果]提取了10个拮抗链霉菌菌株的基因组DNA，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示其主带清晰，片段大小为37.64-40.86Kb，无降解现象，亦无RNA残留；其OD260/OD280为1.625-1.833；Pst I／Mse I双酶切产物琼脂糖电泳呈弥散荧光长带，说明酶解充分；筛选出的3对引物对DNA模板的扩增谱带清晰，多态性丰富。[结论]该研究建立的DNA模板制备方法及其扩增反应体系可用于链霉菌的AFLP分析。     

猕猴桃基因组DNA不同提取方法的研究

4种经优化的DNA提取方法即CTAB区室法、SDS区室法、CTAB常规法、SDS常规法提取猕猴桃嫩叶基因组DNA，效果均好。经综合对比分析，本实验认为CTAB常规法是适于AFLP分析最佳的提取方法，因其步骤简单、快捷，得到的基因组DNA降解少、杂质含量少，能获得高质量的DNA模板。通过对所得到的基因组DNA模板进行AFLP分析，得到了清晰的DNA指纹图谱。     

药用植物草珊瑚AFLP反应体系的建立

从草珊瑚(Sarcandra glabra)的幼嫩叶片中提取基因组DNA,建立草珊瑚AFLP反应体系,对AFLP反应体系中模板DNA的浓度、基因组DNA的双酶切时间、预扩增产物的稀释倍数和引物组合的筛选等关键因素进行摸索.优化的草珊瑚AFLP反应体系为模板DNA的用量20 ng/μL、酶切反应时间4h、预扩增产物稀释15倍,初步筛选出8对较为适合草珊瑚AFLP分析的引物组合.     

黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究

［目的］提取黄瓜基因组DNA，并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料，利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA，通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系，得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应，改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析，形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜，酶切连接的基因组DNA用量为200 ng，预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系，预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。     

大竹蛏AFLP分子标记反应体系的建立与优化

[目的]建立一套适合大竹蛏的AFLP分子标记反应体系,为大竹蛏的遗传多样性研究提供技术支持。[方法]采用比较实验法,以大竹蛏基因组DNA为模板,对其AFLP体系中的酶切时间、预扩产物稀释倍数及选扩引物E＋3/M＋3的配比等进行优化。[结果]优化的AFLP体系为：酶切时的DNA模板浓度为100 ng/μl,双酶切2 h;预扩模板最佳用量1.0μl;预扩产物的最适稀释倍数为40倍;选扩引物浓度配比为1∶4。同时,筛选出12对引物组合,可用于大竹蛏的AFLP分析。[结论]采用优化的AFLP反应体系及筛选后的引物,对大竹蛏群体进行了初步扩增,得到了清晰的电泳图谱。     

AFLP技术流程的改进及其在种子研究中的应用

概述了扩增片段长度多态性（AFLP）在模板、酶切、扩增体系、检测和分析方法等方面的技术流程,并探讨了近年来AFLP在种子研究中的应用。     

杜仲AFLP反应体系的建立及优化

【目的】建立并优化适合杜仲的AFLP技术体系,为进一步构建其遗传图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对杜仲基因组DNA提取方法、酶切与连接体系、预扩增和选择性扩增程序的影响因素进行分析,并对适合杜仲AFLP分析的引物组合进行筛选。【结果】模板DNA的提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量500 ng,酶切时间6 h,连接反应时间6 h,预扩增产物最适稀释倍数30倍。同时筛选出E-AAG+M-CAA,E-AAG+M-CAT,E-AAG+M-CTA,E-AAG+M-CTG,E-ACA+M-CAA,E-ACA+M-CTA,E-ACC+M-CTG共7对适合杜仲AFLP分析的引物组合。【结论】经重复验证,建立的AFLP反应体系适用于杜仲的AFLP分析。     

嵩草AFLP分析体系的建立及引物筛选

【目的】建立一套适用于嵩草的AFLP技术体系。【方法】参考前人在其他物种上的研究结果,对嵩草AFLP体系的影响因素(包括模板DNA的制备、MseⅠ/EcoRⅠ以及T4 DNA连接酶的浓度、反应时间以及反应体系的组成等)进行研究,建立适用于嵩草的AFLP分析体系,并对引物进行了筛选。【结果】用于酶切的嵩草基因组DNA模板以600 ng为宜,连接最适反应时间为10 h,预扩增产物最适稀释倍数为5倍。E-ACC+M-CAG、E-ACA+M-CAG和E-ACA+M-CTG 3对引物均适合于嵩草AFLP分析,其中以E-ACA+M-CAG引物组合效果最佳,扩增出101条多态性带,多态性带比率为99.02%。【结论】建立的AFLP技术体系可用于嵩草AFLP分析,用该体系可得到条带清晰多态性好的嵩草AFLP指纹图谱。适合嵩草种质资源研究的引物组合有E-ACC+M-CAG,E-ACA+M-CAG和E-ACA+M-CTG,其中E-ACA+M-CAG组合的效果最好。     

堇菜属植物AFLP反应体系的建立

以堇菜属17种植物为试材,建立了适合堇菜属植物研究的AFLP反应体系.采用改良的SDS法提取堇菜属植物总DNA,对堇菜AFLP银染反应体系进行优化.在提取液中加人β-巯基乙醇,PVP可有效去除酚类等物质,以满足AFLP分析标记对基因组DNA的纯度高、完整性好的要求.37℃下酶切6h可以将基因组DNA完全切开,预扩增产物稀释35倍作为选择性扩增模板效果好,扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,通过银染,能得到清晰的指纹式样.     

龙眼AFLP分析中DNA模板的制备

采用改良的CTAB法成功地抑制了龙眼DNA的褐化,有效地除处了次生代谢物质,获得了完全适合于AFLP分析的龙眼DNA模板。     

苹果AFLP分析体系的建立

以１２个苹果砧枯木基因型为试材,建立了扩增酶切片段长度多态性（ＡＦＬＰ）分析体系,对其分析过程中ＤＮＡ提取、双酶切、连接、预扩增、标记和选择性扩增的效果进行了检测。用Ｐ３２Ｍ６４引物构建了供试苹果砧木基因型的ＡＦＬＰ指纹图谱。该指纹图谱拥有扩增条带１０５条,多态性带６７条（占６３．８％）,条带清晰可辨,扩增信号强,无背景干扰。讨论了ＡＦＬＰ分析的影响因素。     

基于毛细管电泳的柳树AFLP分子标记研究

为构建柳树遗传图谱、进行分子育种等奠定基础,以柳树为材料,基于毛细管电泳技术体系建立并优化了AFLP分子标记技术,简化了AFLP分析流程。首先提取高质量的柳树基因组DNA,对基因组进行酶切与接头连接、预扩增和选择性扩增,最后通过毛细管电泳分析各因素的影响。基因组DNA提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量450 ng,EcoRⅠ酶切2 h,MseⅠ酶切2 h,接头过夜连接,选择性扩增时dNTP浓度0.3 mmol/L,Mg 2+ 浓度1.5 mmol/L,引物浓度0.125 μmol/L,DNA聚合酶浓度0.025 U/μL,预扩增产物最适稀释倍数20倍。经过重复实验,证明建立的AFLP 毛细管反应体系适用于柳树AFLP分析。      

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

家猪AFLP分析体系的建立

以大白等6个猪品种为试验材料，建立了家猪扩增酶切片段长度多态性(AFLP)分析体系，对其分析过程中DNA提取、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染效果进行了检测。用E39M48引物组合构建了供试猪的AFLP指纹图谱。条带清晰可辨，扩增信号强，无背景干扰。     

厚朴AFLP分子标记体系的建立

以厚朴 Magnolia officinalis为材料，通过对扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系中的酶切模板用量、扩增条件等几个方面进行优化，建立了较为理想的厚朴AFLP反应体系。结果表明：①采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）硅珠法提取的DNA质量较好，适用于AFLP分析。②酶切的基因组DNA以400 ng为宜；预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜；20.00 μL选扩反应体系中Mg²⁺最佳浓度为2.00 mmol·L^－1，三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）最佳浓度为0.225 mmol·L^－1，Taq DNA 聚合酶最佳用量为16.67 nkat时，扩增带清晰且稳定，扩增效果较好。旨在为研究厚朴天然种群的遗传多样性及遗传结构分析、新品种选育及鉴定和遗传图谱构建等奠定理论基础。图7表1参12     

大白菜基因组DNA的提取及AFLP反应体系的建立

1材料与方法1．1材料供试大白菜种质材料32份，分别由北京市农林科学院蔬菜研究中心品种资源库及蔬菜研究中心大白菜育种课题组和中国农业科学院蔬菜花卉研究所国家种质资源中期库提供。材料编号、品种名称、来源地见表1。     

松毛虫AFLP反应体系的建立及引物筛选

为研究不同环境条件下松毛虫的遗传多样性,以油松毛虫为材料研究松毛虫的AFLP反应体系。对选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析。结果显示,在选择性扩增体系中,预扩增产物稀释40倍,Mg2+浓度1.5 mmol/L、dNTP浓度0.2 mmol/L,引物浓度0.500pmol/L,Taq酶用量为1U,扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到稳定的结果。用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合。     

木霉AFLP分子标记技术体系的建立

以摇床培养的木霉菌丝为材料,采用液氮研磨等方法提取到高质量的基因组DNA,能够用于AFLP实验分析,探索和优化酶切-连接反应、预扩增和选择性扩增反应过程中的关键因素,建立了适合木霉AFLP的最佳试验体系和反应条件。利用该技术体系对不同时期保存的菌株及融合子进行AFLP指纹分析,发现不同时期保存的同一菌株指纹相同,融合子指纹兼有亲本菌株的特性。通过对木霉AFLP条件的探索和研究,建立了木霉基因组AFLP反应体系,得到的扩增多态性条带完全能够用于木霉遗传稳定性和多样性分析。     

企鹅珍珠贝AFLP反应体系建立的研究

为了将AFLP技术应用到企鹅珍珠贝相关研究中,以企鹅珍珠贝为材料,采用SDS-CTAB改进法DNA提取高质量的基因组DNA,通过对AFLP双酶切体系、连接体系、预扩增体系及选择性扩增体系中关键因素进行优化,建立了适用于企鹅珍珠贝的AFLP反应体系.同时以3个企鹅珍珠贝地理群体为材料,采用新建立AFLP反应体系从256对引物组合中筛选出10对多态性高的AFLP引物组合,说明建立的优化体系可用于企鹅珍珠贝的AFLP分析.     

节瓜基因组AFLP体系建立的研究

以节瓜雌性系K36和强雄系G为材料,从DNA提取、酶切连接、预扩和选扩等方面进行选择优化,建立高效稳定的AFLP分析体系,同时从64对AFLP引物组合筛选出多态性好的引物组合6对,并以该体系开展节瓜雌性性状分子标记和图谱构建等遗传分析研究。