eSRKs酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础.     

同源重组快速构建甘蓝SCR 酵母双杂交诱饵载体及其自激活作用的检测

采用巢式PCR获得甘蓝SCR的成熟肽编码区,利用同源重组技术首次将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-SCR,结果表明:通过巢式PCR获得了正确的甘蓝SCR成熟肽编码区,并成功构建到pGBKT7诱饵载体中,且转化有诱饵载体的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,而在SD/-His-Trp和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷平板上皆不能生长,说明对报告基因无自激活作用;且毒性实验也表明,SCR蛋白对酵母没有毒害作用.     

白桦开花抑制因子BpFLC与BpSVP酵母表达载体的构建及互作验证

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理,利用PCR技术从白桦幼叶cDNA中克隆出BpFLC和BpSVP基因序列,利用NdeⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶将BpFLC和BpSVP分别整合进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中。pGBKT7-BpFLC及pGBKT7-BpSVP转化酵母Y2Hgold菌株显示无自激活与毒性作用。酵母Y2Hgold[pGBKT7-BpFLC×pGADT7-BpSVP]、Y2Hgold[pGADT7-BpFLC×pGBKT7-BpSVP]均可在QDO/A/X平板上生长,并显示蓝色,说明能激活报告基因HIS3、ADE2、AUR1-C、MEL1,由此表明BpFLC与BpSVP蛋白能够结合,存在互作关系。     

白桦开花抑制因子 BpFLC 与 BpSVP 酵母表达载体的构建及互作验证1）

为深入研究白桦开花抑制因子FLC与SVP的相互作用的分子机理,利用PCR技术从白桦幼叶cD-NA中克隆出BpFLC和BpSVP基因序列,利用NdeⅠ和Eoc RⅠ限制性内切酶将BpFLC和BpSV P分别整合进酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中。 pGBKT7－BpFLC及pGBKT7－BpSVP转化酵母Y2Hgold菌株显示无自激活与毒性作用。酵母Y2Hgold [ pGBKT7－BpFLC ×pGADT7－B pSVP]、Y2Hgold [ pGADT7－BpFLC ×pGBKT7－BpSVP]均可在QDO／A／X平板上生长,并显示蓝色,说明能激活报告基因HIS3、ADE2、AUR1－C 、MEL1,由此表明BpFLC与BpS-VP蛋白能够结合,存在互作关系。     

水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1胞外区酵母双杂交诱饵载体构建

[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶(Leucine rich repeat receptor protein kinase) OsRPK1胞外结构域的互作蛋白.[方法]以日本晴水稻为研究材料,以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD(969 bp).将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-OsRPK1-OD.[结果]对pGBKT7-OsRPK1-OD进行毒性检测和转录自激活鉴定,酵母生长结果发现,含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold细胞,在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-gal/AbA固体培养基上生长受到抑制;在SD/-Trp生长出含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致,显示插入的OsRPK1-OD对酵母生长无毒性作用.[结论]OsRPK1-OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质.     

猪I型补体受体与C3b活性片段相互结合的体外检测

【目的】检测猪红细胞类补体受体I型（Complement receptor 1-like,CR1-like）与C3b活性片段能否发生结合,以期为阐明猪红细胞发挥免疫粘附功能的分子机理提供科学数据。【方法】利用前期已构建的CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)功能域片段的重组质粒建立酵母双杂交检测体系,运用酵母共转化的方法将诱饵质粒（重组pGBKT7-CR1-like）与捕获质粒（重组pGADT7-C3b）共同转入Y2HGold酵母细胞中,分别利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）严格筛选共转化成功的酵母细胞,再根据报告因子是否表达来鉴别转化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培养板上的生长情况,并结合菌落的颜色变化现象综合判定CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞中是否发生相互结合;然后运用免疫沉淀技术分离酵母细胞中CR1-like与C3b结合复合物,并对该复合物的特异性进行Western blot鉴定。【结果】试验成功将pGBKT7-CR1-like与pGADT7-C3b基因共转入Y2HGold酵母细胞。共转化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能够正常生长,在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生长且菌落呈现蓝色,由此表明,试验中酵母双杂交系统建立成功,并通过试验获得了阳性酵母克隆。共同转化了pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b质粒的酵母菌落PCR反向鉴定结果显示,在共转化的酵母菌中含有目的基因CR1-like_(3-6)和CR1-like_(8-11),共转化组的质粒酶切后出现C3b基因片段,与设计大小一致,说明重组质粒成功共转化入酵母细胞中。免疫沉淀试验中应用pGBKT7载体的标签抗体c-Myc沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以c-Myc为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like_(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like_(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以HA单克隆抗体为一抗进行Western blot检测时,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,只有3、4泳道中共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在CR1-like与C3b识别结合的复合物。使用CR1-like单克隆抗体沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以CR1-like单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like_(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like_(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以C3单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,泳道3、4所示只有共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在具有生物活性的CR1-like与C3b识别结合的复合物。通过多个单克隆抗体杂交结果,可看出诱饵质粒的表达产物CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)片段与捕获质粒的表达产物C3b片段可在酵母细胞内发生结合。【结论】猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的识别配体为C3b,为猪红细胞CR1-like功能域分子结构的进一步解析提供了重要数据依据。     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

【目的】构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds c DNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建c DNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析。【结果】构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106CFU,文库滴度为3.1×108CFU/mL,插入片段大小集中在300～2000 bp,重组率为91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9)。【结论】通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。     

IHHNV编码蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活研究

应用酵母双杂交体系,构建凡纳滨对虾IHHNV 3个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体,并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测,为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾IHHNV病毒3个开放阅读框的基因片段进行PCR特异性扩增,并运用In-Fusion技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7进行连接,获得重组质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2,并进行自激活和毒性检测。结果表明,pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2等3个重组质粒对MEL1报告基因无自激活性;对AUR1-C报告基因无自激活作用,pGBKT7-CP,pGBKT7-NS1,pGBKT7-NS2和空载体的酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD_(600)均大于0.8,说明诱饵载体无毒性且不具自主激活报告基因的功能,所获得的无自激活作用的诱饵载体可用于酵母双杂交试验。     

长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白，为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术，对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析，并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白，包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系，构建了pGADT7-PBP1 重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2 重组诱饵质粒，通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测，表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示，诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO 培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用，不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。     

基于SRK和SCR序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析

采用RT-PCR和其他分子生物学方法,以甘蓝自交不亲和系E1和F1柱头cDNA为模板扩增SRKE1和SRKF1基因,以花药cDNA为模板扩增SCRE1和SCRF1基因.经序列比对首次证明E1和F1材料分别为S28和S7单倍型.经三维结构分析,预测SCRE1上C5-C6和C7-C8之间氨基酸序列决定SCRE1的单倍型特异性,SRKE1上TNNSFYSRLKVS序列决定了SRKE1的单倍型特异性,并对两者相对作用的关键氨基酸位点进行了分析.     

氮、磷肥对苏北沿海滩涂海滨锦葵生长及品质的影响

以海滨锦葵为材料,在沿海滩涂上研究了不同施氮水平(0、75、150、225 kg/hm2)与施磷水平(0、30、60、90kg/hm2)对海滨锦葵生长及品质的影响.结果表明:施用氮磷肥对海滨锦葵生长、籽粒产量及品质影响显著.N2(75kg/hm2)-N4(225kg/hm2)、P2(30kg/hm2)-P4(90kg/...     

阿月浑子及黄连木种子处理试验

中国阿月浑子种子可分为开裂与不开裂两种类型,具有不同的发芽特性.其种子经低温砂藏后发芽率明显提高.开裂种子发芽势高于不开裂种子.中国黄连木种子最佳的低温砂藏时间为100d左右,最高发芽率为57.5%.引进美国Atlantica黄连木发芽率为67.7%,UCB-1黄连木为61.5%,PG-1黄连木为2.1%.     

抗保幼激素与蜕皮激素的作用机理研究

桑蚕第３龄或第４龄使用三眠素能使龄数减少，全龄期缩短，５龄使用则使龄期延长．３龄使用金鹿三眠素或５龄添用蜕皮激素丝腺重量低于对照，但三眠素使用区单位重量丝腺的ＲＮＡ量与对照有表现一致的趋向；而５龄使用三眠素则丝腺重量大于对照区．研究表明，３龄使用三眠素，蚕体强健，茧层率较高；５龄使用三眠素，全茧量、茧层量、茧层率均优于对照．使用蜕皮激素、龄期缩短，强健性，茧质成绩均较差     

牛蒡提取物抗疲劳作用的研究

将雄性BALB/C小鼠按体重随机分为4组:空白对照组和2.0、4.0、6.0 g/kg 3个牛蒡提取物剂量组。在给予受试物20 d后测定各组小鼠负重游泳的持续时间,10 min无负重游泳的血乳酸水平(静息值、即刻值、游泳后20 min值)及肝糖原含量的变化。结果2.0、4.0、6.0 g/kg剂量的牛蒡提取物能提高肝糖元的储备(p<0.05,p<0.01);4.0、6.0g/kg剂量组游泳时间长于空白对照组(p<0.05);4.0、6.0g/kg剂量组血乳酸降低比值高于对照组(p<0.05,p<0.01)。结论:牛蒡提取物具有明显抗疲劳作用。     

甜质型和普通型玉米籽粒发育过程中糖组分比较研究

 利用高效液相色谱 (HPLC)技术比较分析了甜质型 (ZeamaysL .SeccharataSturt)和普通型玉米 (ZeamaysL .IndentataSturt)籽粒中糖组分的动态变化规律。结果表明 ,籽粒发育初期 (授粉后 10d) ,2类型间糖组分差异不显著 ,均含有水溶性多糖 (WSP)、蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨醇和甘露醇 ;授粉 2 0d后 ,甜质型玉米能积累 2种聚合度不同的WSP(其保留时间分别为 5 .2 8和 5 .98min) ,而普通型玉米仅有其中的 1种 (保留时间为 5 .98min) ;整个籽粒发育过程中未测得麦芽糖。甜质型玉米随籽粒发育其可溶性总糖 (TSS)含量增加 ,而普通型玉米的含量降低 ,其中WSP、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇在 2类型玉米籽粒发育过程中的动态变化不同。甜质型玉米的直链、支链淀粉含量较普通型玉米少 ,其中直链淀粉含量随籽粒发育而降低 ,支链淀粉含量则升高。     

《上海农学院综合服务社》正式成立并开始服务

《上海农学院综合服务社》经上海市高教局[沪高教基(86)第536号]批准并于1986年6月7日正式成立。该社决心遵守国家各项政策、法令、严格按工商部门核定的经营范围经营,不仅积极努力为学校教学、科研、师生员工生活服务,而且热忱为全国各省市兄弟院校、科研单位等提供上海市场各类有关产品的产销、供应情况及其动向的咨询。同时还可以为您代销产品、代     

钾和甜菜碱对减缓冬小麦水分胁迫的效果

采用盆栽试验研究了水分胁迫和适量供水条件下,供应钾和甜菜碱对冬小麦(陕757)各生育期干物质量、籽粒产量和水分利用效率的影响,以确定这两种物质在增强作物抗旱性方面的功能。结果表明,水分胁迫条件下干物质量和籽粒产量明显降低,施用钾和甜菜碱可显著增加冬小麦干物质量和籽粒产量,提高水分利用效率,减缓水分胁迫;增产效果随钾肥用量的增加而提高,不同用量间差异显著。适量供水条件下,供应钾和甜菜碱的作用效果不明显,甚至产生不良效应。该结果说明,钾肥与甜菜碱的作用不仅在于供应养分,其对作物抗旱性的增强也有重要作用。     

苦参碱对小菜蛾幼虫毒力测定及其对害虫体内2种酶活性的影响

采用生物测定和酶活力测定方法，研究苦参碱对小菜蛾Plutella xylostella L．的胃毒活性及其对幼虫体内谷胱甘肽-S-转移酶、乙酰胆碱酯酶活性的影响。试验结果表明：苦参碱对小菜蛾幼虫具有一定的胃毒作用。2mg／mL苦参碱处理叶片饲喂小菜蛾幼虫12h校正死亡率为37．93％，72h后小菜蛾幼虫的校正死亡率为95．83％。不同质量浓度苦参碱处理小菜蛾幼虫后，幼虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）和乙酰胆碱酯酶（AchE）活力与对照相比均产生波动。经125×10 -3mg／mL苦参碱处理4h，小菜蛾体内GSTs活力最高，为1610．72U／（mg·min）。经125×10mg／mL苦参碱处理16h，小菜蛾体内的AChE酶活力最高，为10．63U／（mg·min）。各处理24h，小菜蛾体内GSTs活力和AChE酶活力均有明显降低。说明苦参碱对小菜蛾幼虫体内谷胱甘肽-S-转移酶活力和乙酰胆碱酯酶活力有一定的影响。     

The Comparison of Sugar Components in the Developing Grains of Sweet Corn and Normal Corn

The sugar components and their dynamic variation in the developing grains of sweet corn(Zeamays L. seccharata Sturt)and normal corn (Zea mays L. indentata Sturt) were compared. There are WSP(water-soluble polysaccharides), sucrose, fructose, glucose, mannitol and sorbitol in both sweet corn and nor-mal corn, but no maltose. Two components with different degrees of polymerization (D. P. N) were detected inthe sweet corn; only one of them was detected in the normal corn 20 days after pollination. With the develop-ment of grains, the total soluble sugar content(TSS)in sweet corn increased, but in normal corn it decreased.The dynamic variation of WSP, sucrose, glucose, fructose, mannitol and sorbitol in sweet and normal corngrains are different. The contents of sugar components in the sweet corn grains are higher than that in the nor-mal corn. Sweet corn accumulates less starch than normal corn.