FSH对体外培养猪卵巢颗粒细胞生长及增殖的影响

采集成年健康母猪的卵巢,收集卵泡颗粒细胞,在配制好的培养液中培养。颗粒细胞原代培养体系建立成功后,分别将不同质量浓度的FSH(0.1,0.5,1,5,25 ng/mL)作用于细胞,每隔48 h换1次培养液,加入新的FSH,倒置显微镜下检测细胞的生长及增殖状况。结果表明,FSH质量浓度越大,细胞生长状况越好,差异有统计学意义(P<0.05);在固定质量浓度的FSH作用下,细胞每次换液后生长状况都会变好。FSH能促进猪卵泡颗粒细胞增殖,并与作用时间长短有关。     

SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定

为进一步简化、优化SD大鼠睾丸支持细胞的体外培养条件及鉴定方法,采用三酶两步消化法和差异贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞,并用HE染色、油红染色、Feulgen染色及透射电镜扫描其超微结构予以鉴定。结果表明：平均0．10g睾丸组织可获得2．5×10^6个支持细胞,细胞存活率90％以上,体外培养5h后开始贴壁,96h后细胞生长速率下降,其对数生长期为3—7d,整个体外生长周期约为10～15d。对获得的纯化细胞进行鉴定,发现其形态结构及超微结构与支持细胞的形态特征一致。可见,采用三酶两步消化法和差异贴壁法,可达到分离、培养、纯化SD大鼠支持细胞的目的。     

新生牛睾丸支持细胞的体外培养及鉴定分析

为探究支持细胞的体外培养特性,以新生牛睾丸组织为试验材料,利用组合酶消化法将其解离成单细胞悬液,并采用差速贴壁法纯化支持细胞后进行体外培养与鉴定.结果表明:支持细胞体外培养能够传至第20代,并且随着传代次数的增加,支持细胞的增殖速度越来越慢;添加2％血清浓度的DMEM/F-12的培养基即可用于支持细胞的体外培养;免疫组化染色显示,所培养的细胞内波形蛋白呈阳性;RT-PCR检测结果可见支持细胞标志基因SCF和GDNF的表达;第15代的支持细胞内含有正常的二倍体核型.     

FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和 cyclin E1 mRNA表达的影响

【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR 检测cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH（0—100 ng•mL-1）均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在FSH浓度为50 ng•mL-1时两种基因的表达量最大（P＜0.05）;FSH（50 ng•mL-1）也以时间依赖的方式促进了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,在作用30 min时其表达量达到高峰（P＜0.05）。不同浓度的Foskolin （0—20 μmol•L-1）均可以促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,但均低于FSH单独作用时两种基因的表达量;Rp-cAMP（0—40 μmol•L-1）、H-89（0—30 μmol•L-1）和Verapamil（0—100 μg•mL-1）以剂量依赖的方式抑制了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而且Rp-cAMP和Verapamil联合作用对FSH的抑制效果高于单独的抑制效果（P＜0.05）,但低于两者之和。此外,不同浓度的U0126（0—10 μmol•L-1）降低了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达（P＜0.05）,而Rp-cAMP、H-89、Verapamil和U0126单独作用时,cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达与对照相比没有显著差异（P＞0.05）。【结论】FSH以剂量依赖和时间依赖的方式诱导了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达;cAMP-PKA、Ca2+和ERK1/2参与了FSH对cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的调节。     

大鼠睾丸支持细胞的分离纯化与鉴定

采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。     

卵泡刺激素对原癌基因c-myc在鸡卵泡上表达的影响

[目的]本试验旨在研究c-myc基因在鸡卵泡上的表达及卵泡刺激素(FSH)对其的诱导作用,为明确c-myc在鸡卵泡发育过程中的相关机制提供理论基础。[方法]体外分离鸡小白卵泡(SWF)、大白卵泡(LWF)、小黄卵泡(SYF)、F4和F1卵泡颗粒层和膜层,检测c-myc mRNA和蛋白的表达;应用50 ng·mL^-1FSH处理小黄卵泡36 h,测量卵泡颗粒层的厚度和密度,检测颗粒层和膜层c-myc、标记基因和周期相关基因的表达;体外分离、培养小黄卵泡颗粒细胞,预培养16 h,用siRNA干扰c-myc 24 h后,加入50 ng·mL^-1 FSH处理24 h,检测c-myc mRNA的表达。[结果]c-myc mRNA在等级前卵泡的颗粒层和膜层的表达水平都显著高于排卵前卵泡,卵泡的颗粒层和膜层上都有c-Myc蛋白表达。与对照组相比,FSH处理后,小黄卵泡颗粒层厚度增加约25.5%(P<0.05),密度增加约27.8%(P<0.01)。在小黄卵泡颗粒层上,FSH降低了c-myc和类固醇激素合成急性调节蛋白(star)mRNA的表达水平...     

鸭胚睾丸支持细胞的分离培养与鉴定

为探究鸭胚睾丸支持细胞的分离培养方法,选取２４日胚龄的麻鸭鸭胚４０个,取出睾丸,采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶二步消化分离睾丸细胞,差异贴壁与低渗处理的方法进行纯化,于３７℃,体积分数５％二氧化碳条件下培养,最终得到纯度较高的支持细胞．经染色鉴定,发现罗丹明１２３染色显示支持细胞中富含线粒体;ＡＫＰ检测发现８０％的细胞呈ＡＫＰ阴性;吖啶橙染色显示支持细胞细胞质中富含ＲＮＡ;油红Ｏ染色显示睾丸支持细胞细胞质中含有大量脂肪滴,细胞核内可见双极小体．本试验结果说明采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶结合消化,经差异贴壁与低渗出处理纯化,可得到较高纯度的支持细胞;结合罗丹明１２３染色法、ＡＫＰ染色法、吖啶橙染色法与油红Ｏ染色法可有效鉴定支持细胞．     

牛磺酸对体外培养大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌的影响

通过在基础培养液(DMEM)中添加不同水平的牛磺酸和人绒毛膜促性腺激素(HCG),研究了牛磺酸(1～100 mg/L)对体外培养大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌性能的影响。结果表明,牛磺酸(1～100 mg/L)对体外培养大鼠睾丸间质细胞睾酮的分泌有显著的促进作用(P<0.01);而对HCG刺激的睾丸间质细胞睾酮的分泌表现出双相作用,低剂量牛磺酸对其有明显的促进作用(P<0.05),高剂量则有显著的抑制作用(P<0.05)。     

睾丸支持细胞对体外精子活力的影响

通过建立小鼠睾丸支持细胞与精子共培养的方法,达到体外提高精子活力的目的.利用睾丸组织切片技术,观察并分析支持细胞对生精细胞的作用.从6~7日龄小鼠睾丸中分离睾丸支持细胞,体外培养两天后,形成细胞单层作为滋养层.取小鼠附睾尾内精子,转移到以支持细胞为滋养层的培养液中培养,同时设立对照组.通过精子分析仪观察各组精子的活力,结果显示,以支持细胞为滋养层的精子前向运动百分比为56.1±5.81%,显著高于对照组40.7±2.96% (P<0.05).利用激光共聚焦显微镜观察精子结构,结果显示两组精子形态结构差异不显著,表明支持细胞能够提高体外精子的活力,但不改变精子的形态结构.     

FSH和17β-雌二醇联合作用对仔猪睾丸 支持细胞Skp2表达的调节

 【目的】确定FSH和雌激素联合作用是否可通过ERK1/2级联调节培养条件下未成熟仔猪睾丸支持细胞中Skp2的表达。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用Western blotting和实时荧光定量PCR检测Skp2蛋白、mRNA的表达。【结果】FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用时以时间依赖的方式促进了Skp2蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,这一作用在30 min时到达高峰;FSH（50 ng·mL-1）、17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）和forskolin单独作用均促进了Skp2蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对Skp2表达的影响与FSH或17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）单独作用无显著差异（P≥0.05）,而环磷酸腺苷抑制剂（Rp-cAMP）、蛋白激酶A（PKA）抑制剂（H-89）、L-Ca2+离子通道抑制剂（verapamil）和ERK1/2抑制剂（U0126）单独作用时对Skp2蛋白和mRNA的表达与空白对照相比无显著影响（P＞0.05）,但都抑制了FSH（50 ng·mL-1）与17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对Skp2蛋白和mRNA表达的影响（P＜0.05）。H-89、verapamil单独作用对ERK1/2（细胞外信号调节的蛋白激酶1/2）活性没有影响,但降低了FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对ERK1/2活性的影响。【结论】 FSH与17β-雌二醇联合作用激活了cAMP-PKA级联和Ca2+内流,而PKA和Ca2+内流又通过影响ERK1/2的活性进而影响Skp2的表达。     

Ghrelin对雌性大鼠促性腺激素分泌及其mRNA表达的影响

【目的】探明Ghrelin在中枢水平上对雌性大鼠促性腺激素分泌及其mRNA表达的影响。【方法】用1 nmol Ghrelin对不同发情周期(发情前期、发情期、发情后期、间情期)雌性大鼠及用不同剂量(0.3,1和3 nmol)Gh-relin对发情后期雌性大鼠分别进行侧脑室注射,15 min后断头采血,离心血清,同时采集脑垂体,采用酶免法测定血清促黄体素(LH)、促卵泡素(FSH)的质量浓度,用实时荧光定量PCR法检测LH mRNA、FSH mRNA在垂体中的表达。【结果】①在发情前期和间情期,Ghrelin可显著抑制雌性大鼠LH的分泌和LH mRNA的表达(P0.05);Ghre-lin对整个发情周期中FSH的分泌不产生影响,仅在发情期抑制FSH mRNA的表达(P0.05)。②在发情后期,0.3和1 nmol的Ghrelin对大鼠促性腺激素分泌和mRNA表达均无影响,但3 nmol的Ghrelin可显著抑制LH、FSH的分泌和LH mRNA的表达(P0.05)。【结论】Ghrelin在中枢水平上对FSH、LH的释放及FSH mRNA和LH mR-NA的表达均有抑制作用,但存在一定的剂量差异,并受发情周期的调节。     

成年公兔血清FSH、LH和T水平的研究

通过外科手术连续收集活体公兔外周血样 ,用放射免疫法测定血清促卵泡素 ( FSH)、促黄体生成素 ( LH)和睾酮 ( T)水平。 5只健康成年公兔分别安置颈静脉导管 ,以 2 0 min间隔连续采样 1 0次。结果表明 ,血清 FSH、LH和 T含量分别为 ( 2 4 4.95± 4 5.4 9) IU/ L、( 443.64± 1 88.4 4) IU/ L和 ( 1 32 .4 6± 99.2 4 ) nmol/L;LH和 T均呈波动式释放 ,而 FSH的波动性不明显     

Nesfatin-1对初情期雌性大鼠促性腺激素及其mRNA表达的影响

为探究侧脑室注射Nesfatin-1对雌性大鼠促性腺激素水平及其mRNA表达的影响,对初情期前雌性大鼠的侧脑室注射Nesfatin-1,采用实时荧光定量PCR法检测促黄体素(Luteinizing hormone,LH)和促卵泡素(Folliclestimulating hormone,FSH)mRNA在垂体中的变化,采用酶联免疫分析法检测血清LH和FSH的浓度。结果表明:在初情期前的雌性大鼠中,Nesfatin-1可促进初情期启动、增加卵巢重量、血清LH水平、垂体LH mRNA和FSH mRNA的表达增加(P0.05);但Nesfatin-1对FSH水平的影响不突出,注射后15min时增加(P0.05),60min不产生影响(P0.05)。侧脑室注射Nesfatin-1后15和60min均能提高血清LH水平,15min时提高更明显(P0.05),但对FSH水平的影响不尽相同。在成年的雌性大鼠中,Nesfatin-1对LH和FSH的分泌不产生影响(P0.05)。Nesfatin-1可通过下丘脑诱导和增强初情期过渡阶段雌性大鼠LH和FSH的释放及LH、FSH mRNA的表达。     

CDC25B Involved in Proliferation of Sertoli Cells of New Born Calves Through FSH and Possibly Being Key Regulating Factor

The effects of FSH on the proliferation of sertoli cells of new born calves were studied in order to provide some data for theoretical research and practical use of spermatogenesis in vitro. Different concentrations of FSH(0, 0.01, 0.02, 0.04, and 0.08 IU · mL~(-1)) were taken to treat bovine sertoli cells in vitro culture, the number of sertoli cells and the expression of seven genes were determined at 6, 12 and 24 h after FSH treatments. FSH could significantly promote the proliferation of in vitro cultured sertoli cells. FSH had no significant effects on the expression of CDC25A and could significantly improve the expression of CDC25B. 0.04 IU · mL~(-1) and 0.08 IU · mL~(-1) FSH treatments decreased the expression of CDC25C at 12 h. 0.08 IU · mL~(-1) FSH treatment decreased the expression of CDC25C at 24 h. 0.04 IU · mL~(-1) FSH could significantly decrease the expression of GSK-3β and improve the expression of β-catenin at 6, 12 and 24 h. 0.02, 0.04 and 0.08 IU · mL~(-1) FSH treatments enhanced the expressions of CYCLIND1 and C-MYC. In conclusion, FSH promoted the proliferation of sertoli cells and 0.04 IU · mL~(-1) FSH concentration could significantly promote the proliferation of in vitro cultured sertoli cells. FSH promoted the proliferation of sertoli cells by CDC25B and WNT/β-catenin and CDC25B might be the key regulator to the proliferating rate of sertoli cells of bovine calf.     

Follicle-stimulating hormone is expressed in ovarian follicles of chickens and promotes ovarian granulosa cell proliferation

Follicle-stimulating hormone(FSH), an important hypothalamic-pituitary-gonadal axis(HPG) hormone, is secreted by the pituitary gland. This study confirms that FSH is expressed in chicken follicles at different stages, and positive FSHβ mRNA signals were stronger(P0.05) in granulosa cells than in oocytes. The 369 bp coding sequence of FSHβ in ovaries is 100% identical to that in the pituitary gland. The experiment in vitro revealed that the ovary possessed FSH secretory capacity. Further, FSHβ mRNA was significantly upregulated(P0.05) in follicles and significantly higher(P0.05) than that in the pituitary gland by approximately 2–23 times with the development. The number of granulosa cells decreased significantly(P0.05) in the cells with siRNA treatment, confirming that the ovarian FSH could promote granulosa cell proliferation. This view was supported by cell cycle analysis and CCND2 and CCNE2 expression. Further research indicated that no difference(P0.05) was observed between the number of granulosa cells treated with FSHβ siRNA and in exogenous FSH. However, the number of granulosa cells without FSHβ siRNA transfection was significantly higher(P0.05) for exogenous FSH. This finding suggests that the proliferative effect of exogenous FSH on ovarian granulosa cells depend on endogenous FSH. This study demonstrated that the FSH gene was expressed in chicken follicles and promoted ovarian granulosa cell proliferation, which enriched the theory on HPG axis.     

Inlfuence of FSH Treatment on Expression of CDC25A,TSSK3 and P53in Vitro Cultured Sertoli Cells of Calf

CDC25A, TSSK3 and P53 expressionsin vitro in cultured sertoli cells after FSH treatment were studied in order to provide some data for further researches of spermatogenesis. Different concentrations of...     

视黄醇对仔猪睾丸支持细胞体外生物学特性的影响

支持细胞是构成曲细精管上皮的重要组成细胞,视黄醇及其衍生物是雄性动物睾丸发育和精子发生中所必须的物质,支持细胞是睾丸内视黄醇及其衍生物作用的靶细胞。本研究以3~5周龄仔猪睾丸支持细胞为材料,通过分析视黄醇对体外支持细胞活力、增殖和凋亡相关基因表达、相关细胞因子转录及合成的影响,评价视黄醇对支持细胞体外生物学特性的影响。结果显示,与对照组相比,视黄醇添加浓度达到5.000、0.125 μmol·L^-1时,显著抑制培养24 h和72 h的细胞活性(P<0.05);添加1.250 μmol·L^-1视黄醇组和对照组相比,增殖相关基因PCNA、BCL-2和C-MYC显著下调(P<0.05),凋亡相关基因BAX显著上调(P<0.05),且支持细胞内GDNF、CSF-1和EGF在基因表达和蛋白质水平上均显著降低(P<0.05)。体外培养条件下,添加视黄醇抑制支持细胞活性,促进细胞凋亡。