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相似文献
 共查询到17条相似文献,搜索用时 156 毫秒
1.
[目的]研究了植物病毒表达载体pCIYVV/CP/W的构建及用pClYVV/CP/W表达绿色荧光蛋白(GFP),为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pCIYVV基因组的NIb/CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pCIYVV/CP/W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pCIYVV/CP/W中构建pCIYVV/CP/W/GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pCIYVV/CP/W/GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型CIYVV相同的症状,发病率达100%,表明重组病毒克隆pCIYVV/CP/W/GFP.有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pCIYVV/CP/W的开放阅读框;以感染叶总RNA为模板,对pCIYVV/CP/W/GFP表达GFP外源基因的稳定性进行了检测,从F0(重组病毒质粒最初转录出的病毒)一直检测到Fd子代病毒。检测结果表明,外源基因在L子代病毒基因组中稳定存在;以从感染叶中提取的总蛋白为抗原,以GFP抗体为第1抗体,以碱性磷酸酶标记抗体为第2抗体,用Western杂交对重组病毒克隆pCVYVV/CP/W/GFP表达外源蛋白进行了定性检测。从F0一直检测到F4子代病毒。检测结果表明,重组病毒克隆pCIYVV/CP/W/GFP至少到F4子代病毒能稳定表达GFP。  相似文献   

2.
用植物病毒载体表达小球状病毒抗原蛋白的研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
将引起人类腹泻主要病原物小球状病毒(Small round structured virus;SRSV)编码抗原蛋白基因的全长序列1605bp,导入来自三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus;ClYVV)侵染性全长cDNA克隆的侵染性植物病毒表达载体pClYVV/CP/W基因组的NIb/CP基因之间,构建了重组病毒克隆pClYVV-NV1.6。用上述重组病毒克隆接种蚕豆植物,表现了与野生型ClYVV相同的症状。从发病叶中提取总RNA,用反转录PCR(RT-PCR)对上述重组病毒克隆的转录进行了检测,结果表明,外源基因在F4子代病毒基因组中仍然稳定存在。从发病叶中提取总蛋白,用酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay;ELISA)及蛋白质杂交(Western blotting;WB)对上述重组病毒克隆表达的目的基因产物抗原蛋白进行了测定,结果表明,重组病毒克隆pClYVV-NV1.6之目的基因产物的表达量随寄主植物发病后时间的推移而变化,最大表达是在寄主植物发病后第9天,最大表达量为每克鲜叶可表达160.00μg,这一研究结果为用植物生产抗SRSV口服疫苗提供了有力的基础。  相似文献   

3.
构建了可溶性甲烷单加氧酶C亚单位(soluble methane monoxygenase-C component,sMMO-C)基因和绿色荧光蛋白-S65T(green fluorescence protein,GFP-S65T)基因的融合基因sMMO-C/GFP-S65T.将融合基因sMMO-C/GFP-S65T克隆到三叶草黄脉病毒 (glover yellow vein virus,ClYVV)侵染性植物表达载体pClYVV/CP/W的NIb/CP基因之间,构建了侵染性霞组病毒克隆pCV-mmoC/GFP-S65T.RT-PCR检测结果表明,sMMO-C/GFP-S65T在子代病毒基因组中获得了转录.用GFP抗体进行蛋白质杂交(western blotting,WB),检测到25kDa左右的GFP蛋白,这一结果表明GFP蛋白在被pCV-mmoC/GFP-S65T侵染的寄主植物中获得了表达,并被病毒自身编码的Nla蛋白酶从病毒聚合蛋白及sMMO-C/GFP-S65T融合蛋白中自动切断.可见,sMMO-C亚单位蛋白在植物中获得了表达,因在sMMO-C/GFP-S65T中sMMO-C位于GFP上游.  相似文献   

4.
[目的]研究植物病毒表达载体pC1YVV/CP/W的构建及用pC1YVV/CP/W表达绿色荧光蛋白(GFP),为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pC1YVV基因组的Mb/CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pC1YVV/CP/W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pC1YVV/CP/W中构建pC1YVV/CP/W/GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pC1YVV/CP/W/GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型C1YVV相同的症状,发病率达100%,表明重组病毒克隆pClYVV/CP/W/GFP有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pClYVV/CP/W的开放阅读框;外源基因在F_4子代病毒基因组中稳定存在;重组病毒克隆pC1YVV/CP/W/GFP至少到F_4子代病毒能稳定表达GFP。[结论]该研究结果为用植物表达有用蛋白提供了有用的植物病毒载体。  相似文献   

5.
【目的】构建柑橘黄化花叶病毒(citrus yellow mosaic virus,CYMV)侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14株尤力克柠檬植株中有4株呈RT-PCR阳性,并观察到点状褪绿症状;提取侵染植株系统新叶DNA,PCR扩增获得预期的覆盖CYMV基因组全长的特异性片段;以CYMV-3侵染显症植株为毒源嫁接接种粗柠檬实生苗,通过RT-PCR在90 dpi可检测到CYMV特异性条带;取CYMV-3侵染显症植株的新叶进行固定切片并电镜观察,可见大小约130 nm×30 nm的杆状病毒粒子,说明CYMV-3为CYMV侵染性克隆。将CYMV-3通过农杆菌介导真空浸润接种10个柑橘品种,注射接种5个柑橘品种并进行RT-PCR检测,结果显示前者侵染率为11.11%—100.00%,后者侵染率为63.16%—90.00%,部分柑橘品种出现黄化、花叶、斑块状黄化等CYMV侵染症状。通过农杆菌介导注射接种本氏烟、玉米、豇豆和高粱,结果显示仅高粱检测到RT-PCR阳性植株,且系统叶片沿叶脉周边出现条状褪绿带,表明CYMV可以侵染高粱。构建了CYMV-3 ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为gfp的突变体,通过农杆菌介导注射接种粗柠檬,RT-PCR检测结果均为阴性,且无侵染症状。【结论】成功构建了CYMV的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射可高效接种柑橘植株,侵染症状在不同品种上具有差异。  相似文献   

6.
【目的】克隆葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)糖基水解酶(glycosyl hydrolase,GH)基因(PvGH),分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式,研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡(PCD)以及影响烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)侵染的能力,为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材,采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长,并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析;利用酵母信号肽诱捕系统(SST)验证PvGH的分泌活性;利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式;同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白,分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致,长度为1 092—1 392 bp,分别编码364—464个氨基酸,与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构...  相似文献   

7.
用BamHI/KpnI从重组克隆PZD-1中切下马铃薯Y病毒脉坏死株系复制酶基因,将其插入质粒PROD2相庆切点中构成植物表达载体。用重组pROD2转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌株,通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种NC89中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明,复制酶基因在转基因烟草中获得品种NC89中获得转基因植株。分子生物学检测  相似文献   

8.
【目的】烟草花叶病毒属(Tobamovirus)是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一,严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒(tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)分离物(TMGMV-JS)的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性,为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样,提取总RNA,利用TMGMV特异检测引物确认阳性后,设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列,通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上,获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性,利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒,经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果,测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt,编码4个功能蛋白,分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白C...  相似文献   

9.
为构建携带水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)主要内层衣壳蛋白53基因和外层衣壳蛋白鼹基因的重组杆状病毒,将目的基因(S3和S8)分别亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual多角体启动子(PH)和plO启动子的下游.经酶切和确证性序列测定,将其转化到DHl0Bac感受态细胞中,获得重组杆粒rbpFBDS3-S8,采用脂质体转染法,将rbpF-BDS3-58转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Si9细胞包装病毒,PCR筛选鉴定重组病毒.结果表明:SD昆虫细胞被侵染72h后,倒置显微镜下观察到细胞增大,培养液和细胞内出现颗粒状物质,部分细胞破裂甚至裂解,说明53和S8基因已整合到重组杆状病毒基因组中,这为开展RGDV主要结构蛋白在昆虫细胞中的表达及其功能研究奠定了基础.  相似文献   

10.
多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育   总被引:1,自引:0,他引:1  
 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)全长衣壳蛋白(CP)基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示:23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明:多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。  相似文献   

11.
魏晓棠  白桦  尼秀媚  张京宣  宋涛 《安徽农业科学》2013,41(5):1916-1917,2164
[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。  相似文献   

12.
对安徽省合肥市采集到的具有明显典型花叶症状的蚕豆叶片进行深度测序,鉴定到样品中存在三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus, ClYVV),并获得了ClYVV的完整基因组序列,随后通过直接测序扩增基因组区域获得完整的基因组ClYVV-HF。获得的ClYVV-HF基因组由9 585个核苷酸组成,不包括poly(A)尾巴。ClYVV-HF的全部核苷酸序列与之前报道的来自日本的分离株(AB011819、NC_003536)和来自韩国的分离株(KF975894)分别具有95.45%和95.10%的核苷酸同源性。进一步分析了ClYVV-HF衍生的小干扰RNA的表征。vsiRNAs的大小为21~22 nt,vsiRNAs的5' 末端碱基偏向于A / U。ClYVV-HF来源的小干扰RNA大多来源于其基因组链中的7个热点,其中5个热点以21 nt vsiRNAs为主。生物学实验表明,ClYVV可通过汁液摩擦接种多种豆科作物。这是有关中国ClYVV分离株全部核苷酸序列的首次报道。  相似文献   

13.
宋涛  李伟涛  彭青  陈宏  尼秀媚 《安徽农业科学》2013,41(13):5674-5676
[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。  相似文献   

14.
根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.  相似文献   

15.
[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。  相似文献   

16.
  目的  中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起小麦黄花叶病的重要病原之一。获得表达CWMV外壳蛋白(coat protein,CP)的转基因烟草Nicotiana benthamiana(OECP)并分析其抗病性,为培育小麦抗病材料奠定工作基础。  方法  利用体外重组DNA技术构建含有CWMV外壳蛋白基因的表达载体,并通过农杆菌介导的转化方法,获得OECP。进一步利用Western Blot和PCR检测明确CWMV的外壳蛋白在OECP中能够正常的表达。  结果  部分转基因阳性植株出现矮化表型。此外,OECP阳性植株接种CWMV后7 d的定量分析表明,OECP中CWMV运动蛋白的表达量显著受到抑制。  结论  在烟草中表达CWMV的CP蛋白基因可显著增强烟草对CWMV的抗病性。  相似文献   

17.
以人肝脏cDNA文库为模板,通过PCR方法扩增出Tropon in基因,将其克隆到pCR-TOPO质粒中,构建表达质粒pET-22 b(+)-TnI,转化大肠杆菌BL 21(DE 3)-RPX并进行诱导表达,表达的目的蛋白占菌体总蛋白的20%以上并主要以可溶形式存在。建立了Tropon in I的非亲和色谱纯化工艺,纯化后蛋白产量约为20 mg/L,纯度在90%以上。体外活性实验表明重组蛋白具有良好的抗血管生成。  相似文献   

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