壳聚糖酶生产菌筛选、鉴定及其酶学性质

以壳聚糖为唯一碳源,筛选获得壳聚糖酶活力较高的菌株,根据菌株菌落形态及ITS序列分析,初步鉴定该菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus).该壳聚糖酶的最适反应温度为55℃,最适pH值为5.6,在45～60℃和pH值4.0～8.0范围内稳定,Mn2+对酶有明显的促进作用,Ag+、Cu2+、Zn2+对酶有明显的抑制作用,其酶学特征表明该壳聚糖酶在壳聚糖降解方面具有应用潜力.     

微生物壳聚糖酶的研究概况

壳聚糖是自然界中最丰富的多糖之一.壳聚糖酶能够降解壳聚糖生成壳寡糖,壳寡糖具有多种生物学特性,用途广泛.壳聚糖酶主要分布在微生物和一些植物中,理化性质较稳定.根据其底物特异性和断裂键的专一性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类.根据已测序壳聚糖酶的氨基酸序列相似性,壳聚糖酶分别属于糖苷水解酶46号、75号和80号.目前,只有2种壳聚糖酶的3级结构被测定.     

壳聚糖酶高产菌的筛选、鉴定与发酵产酶初探

壳聚糖酶(EC3.2.1.132)能催化壳聚糖分子中β-1,4-糖苷键的水解,以获得具有特殊生理活性的壳聚寡糖(聚氨基葡萄糖,聚合度2-10)。该酶在细菌、真菌等多种微生物中存在。采用透明圈法,以壳聚糖为唯一碳源,从11份虾蟹壳堆积的土壤中分离出51株能降解壳聚糖的菌株。经平板初筛、摇瓶发酵复筛以及产酶动力学研究,确定H2为产壳聚酶活力高、发酵时间短的优良菌株。根据其形态及培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为浅玫瑰色链霉菌,并命名为(Streptomyces roseolus DH)。进一步的基本发酵条件研究显示:该菌株发酵最适温度为30℃,发酵液初始pH为7.2,最适碳源为1%胶体壳聚糖,最适氮源为0.5%蛋白胨。此条件下经60 h发酵,发酵液中壳聚糖酶活力可达(6.10±0.12)U/mL。此菌株产酶量高,发酵周期短,具有良好的应用潜力。     

溜曲霉M3b产壳聚糖酶的固体发酵工艺优化及酶学性质

为挖掘专一性壳聚糖酶,从多地土壤中筛选出1株高壳聚糖酶活力的真菌M3b,对其进行了形态学观察和18S rDNA序列鉴定,采用单因素试验和正交试验优化固体发酵工艺,研究纯酶的酶学性质。结果显示,菌株M3b为溜曲霉,其最佳产酶发酵条件为：以水为100%计,1%胶体壳聚糖+1%葡萄糖、0.5%硫酸铵、麸皮∶豆粕=6∶10、接种量为10 %、发酵6 d、初始发酵pH 7.0、发酵温度32 ℃。在此条件下酶活力达到20.56 U/mL,是初始发酵条件的221.3%。SDS-PAGE和酶谱分析发现该菌株只产1种壳聚糖酶,分子质量为40 ku。该酶的酶促反应最适pH值为5.5,最适温度为60 ℃,水解产物聚合度≥2。结果表明,采用溜曲霉进行固体发酵可以显著提高壳聚糖酶的酶活力,降低生产成本,纯化后的壳聚糖酶AtChito40酶学性质稳定,耐酸碱,且能有效地降解壳聚糖。     

壳聚糖酶高产菌的筛选、鉴定与发酵产酶初探

壳聚糖酶(EC3.2.1.132)能催化壳聚糖分子中β1,4糖苷键的水解,以获得具有特殊生理活性的壳聚寡糖(聚氨基葡萄糖,聚合度2-10)。该酶在细菌、真菌等多种微生物中存在。采用透明圈法,以壳聚糖为唯一碳源,从11份虾蟹壳堆积的土壤中分离出51株能降解壳聚糖的菌株。经平板初筛、摇瓶发酵复筛以及产酶动力学研究,确定H₂为产壳聚酶活力高、发酵时间短的优良菌株。根据其形态及培养特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定该菌株为浅玫瑰色链霉菌,并命名为(Streptomyces roseolus DH)。进一步的基本发酵条件研究显示：该菌株发酵最适温度为30 ℃,发酵液初始pH为7.2,最适碳源为1%胶体壳聚糖,最适氮源为0.5%蛋白胨。此条件下经60 h发酵,发酵液中壳聚糖酶活力可达(6.10±0.12) U/mL。此菌株产酶量高,发酵周期短,具有良好的应用潜力。     

重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的纯化和性质研究

研究嗜热枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组酶的纯化和性质。该基因序列全长723bp,编码240个氨基酸。根据基因同源性分析,该壳聚糖酶与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的壳聚糖酶前体基因的同源性最高,为98%。粗酶液经Ni-IDA亲和层析得到电泳级纯酶,比活力高达1 051.8U/mg。经测定,该酶反应最适温度为45℃,最适pH为6.0,在40℃和pH 4.5～8.0下稳定。该酶为内切壳聚糖酶,能够高效降解壳聚糖,生成一系列的壳寡糖,在壳寡糖的制备生产方面具有广阔的应用前景。     

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

壳聚糖酶产生菌的选育及产酶能力研究

从某水产市场附近土壤中分离筛选出4株具壳聚糖酶能力的微生物菌株,其中菌株S03具有较高的产酶能力,经鉴定属于毛霉属(Mmucor sp.)。试验条件下该菌株培养3 d时,发酵液中壳聚糖酶活性最高。并进一步证明该菌株所产壳聚糖酶属于诱导型壳聚糖酶,适量添加葡萄糖有助于壳聚糖酶的产生。     

细菌产壳聚糖酶的性质初探

甲壳低聚糖(chitooligosaccharides)具有抗菌、抗癌以及促进双歧杆菌增殖、增强机体免疫等功能[1]。目前制取方法常用盐酸水解壳聚糖来制备,但该法反应条件较难控制,不易得到较高聚合度的低聚糖,对环境污染严重。已有学者研究利用壳聚糖酶水解壳聚糖来制备甲壳低聚糖,由于其专一性强,反应条件温和,得率高,且不污染环境,已得到广泛的关注。自从上世纪七十年代初期,Monaghan等[2]首次报道B.bassiana中存在壳聚糖酶(chitosanase,EC.3.2.1.99)以来,已在许多细菌、放线菌和真菌等微生物中发现了该酶。MasahiroKurakake等[3]对Bacilluscere…     

细菌产壳聚糖酶的性质初探

甲壳低聚糖(chitooligosaccharides)具有抗菌、抗癌以及促进双歧杆菌增殖、增强机体免疫等功能[1]。目前制取方法常用盐酸水解壳聚糖来制备,但该法反应条件较难控制,不易得到较高聚合度的低聚糖,对环境污染严重。已有学者研究利用壳聚糖酶水解壳聚糖来制备甲壳低聚糖,由于其专一性强,反应条件温和,得率高,且不污染环境,已得到广泛的关注。自从上世纪七十年代初期,Monaghan等[2]首次报道B.bassiana中存在壳聚糖酶(chitosanase,EC.3.2.1.99)以来,已在许多细菌、放线菌和真菌等微生物中发现了该酶。MasahiroKurakake等[3]对Bacilluscere…     

瑞氏木霉中β-葡萄糖苷酶基因功能研究进展

瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是研究纤维素降解的主要模式生物,具有很强的分泌纤维素酶的能力,但诱导纤维素酶基因转录表达的信号分子是什么,整个纤维素酶系的表达是如何被调控的等问题至今仍没有得到明确和合理的答案。初步的研究结果显示β-葡萄糖苷酶在纤维素酶诱导过程中具有重要作用。瑞氏木霉基因组序列测定结果表明,其胞内外存在7种β-葡萄糖苷酶。针对瑞氏木霉中β-葡萄糖苷酶的分类、结构特点、转录差异及其在纤维素酶快速诱导过程中的功能进行了综述和分析。     

脱乙酰几丁质酶降解产物的纸层析分析

对本实验室筛选保存的几株产脱乙酰几丁质酶菌株的产酶条件,如pH值、氮源和金属离子进行初步研究,结果表明,其酶作用最适pH范围为5.0～6.0,氮源及Cu2 、Co2 和Mn2 对脱乙酰几丁质酶有不同程度的促进作用,Zn2 对脱乙酰几丁质酶有较强的抑制作用。用纸层析测定这些菌株在不同产酶条件下发酵产物中壳寡糖的含量和成分,根据产物情况推测酶作用方式,表明不同条件下得到壳寡糖有所变化。     

里氏木霉RutC-30产纤维素酶条件优化研究

[目的]优化里氏木霉RutC-30产纤维素酶的液体发酵条件。[方法]以里氏木霉RutC-30为出发菌株,通过单因素试验研究培养基不同氮源(硫酸铵、尿素、蛋白胨)及浓度、不同碳源(纤维素、乳糖、甘油、葡萄糖)及浓度和不同的初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)对产酶的影响,在此基础上选取氮源、碳源和pH为影响因子采用正交试验探讨里氏木霉RutC-30产纤维素酶的优化条件。[结果]正交试验分析表明,各因素对产酶影响顺序依次为碳源>氮源>pH,里氏木霉RutC-30产纤维素酶的最佳条件是:以1%纤维素为碳源、以0.5%蛋白胨为氮源,初始pH值为4.0,在30℃产酶发酵培养5 d,纤维素酶活力高达7.303 U。[结论]里氏木霉RutC-30经优化培养后,产酶能力可得到大幅度提高,具有潜在的工业应用价值。     

烟曲霉脱乙酰几丁质酶cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究

将烟曲霉的一种胞外脱乙酰几丁质酶（AF CSN）纯化,并测定该酶N-端氨基酸的序列。用此序列推测的寡核苷酸引物扩增得到脱乙酰几丁质酶（csn）的cDNA,其全长为804bp,编码一种251个氨基酸的单肽,对csn的序列比较分析表明,它与茄病镰刀菌在两个区域具有同源性,这两个区域分别有重复天冬氨酸及苏氨酸残基,这说明它与细菌具有相同的演化起源。cns与已知的细菌脱乙酰几丁质酶没有同源性,Southern杂交分析显示,cns在烟曲霉基因组中的单拷贝的。用质粒栽体pET28a(t),csn cDNA被导入E.coli中得到csn的融合蛋白,在IPTG诱导下,E.coli细胞中可获得大量的约28kDa的成熟蛋白。     

基于全基因组序列预测里氏木霉QM6a的分泌蛋白

里氏木霉(Trichoderma reesei)QM6a为重要的产纤维素酶工业生产菌株,为明确其内存在的分泌蛋白,对该菌分泌蛋白进行预测,并明确其特征。利用SignalP、ProtComp等5个软件对该菌中9 143条蛋白质序列进行分泌蛋白预测,并对上述分泌蛋白的氨基酸大小分布情况、信号肽长度及其切割位点等性质进行分析。里氏木霉中含有分泌蛋白356个,其氨基酸长度、信号肽长度与其他植物病原菌不同;信号肽切割位点属于A-X-A类型,与其他已经报道的植物病原真菌、细菌以及卵菌中分泌蛋白信号肽切割位点一致。通过上述生物信息学分析方法有效地实现了里氏木霉分泌蛋白的预测,也证明了分泌蛋白的信号肽切割位点具有物种保守性特点。     

0.4%低聚寡糖素对水稻稻瘟病的防治试验

经过试验表明0．4％低聚寡糖素可以用于防治水稻稻瘟病，2．25L／hm^20．4％低聚寡糖素 2．25L／hm^2原沣源植物营养剂的防治效果最高，3．75L／hm^20．4％低聚寡糖素较次之。0．4％低聚寡糖素不污染环境，对作物安全，不产生药害。虽然25％施保克也有一定的防治效果，但易污染环境，长期使用易使稻瘟病病菌产生抗药性。     

Selection of Trichoderma mutants with enhanced cellulase production and resistant to catabolite repression

Due to high cost and relatively low efficiency of cellulase enzymes used for the saccharification of pretreated lignocelluloses, the improvement of cellulase secreting microorganisms is of vital importance. Trichoderma reesei QM 6a, an excellent source of cellulase was selected in the late 1960's. at Natick Laboratories by its performance on pure cellulose (Solka Floc, Avicel) . QM 6a is the wild parent strain of best existing hypercellulolytic mutants such as Rut C30, VTT-D-80133, L…     

黑曲霉葡萄糖氧化酶在里氏木霉中的分泌表达及其对内源纤维素酶表达的影响

目前饲料工业中所使用的纤维素酶和葡萄糖氧化酶来自不同的表达系统,其生产成本较高;而在同一种微生物宿主中同时表达这两种重要的饲料工业用酶则有可能会降低成本。根据里氏木霉中密码子的偏好性优化黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因god,并利用DNA assembler方法构建pRS424-cbh1P-god-cbh1T质粒(p PGT质粒);通过PEG介导的原生质体转化法,将其转入里氏木霉Tu-6Δtku70尿嘧啶缺陷型菌株中,经筛选得到葡萄糖氧化酶酶活较高的一株转化子(2号),SDS-PAGE分析显示重组GOD的蛋白分子量大小约为70 k Da,进一步使用质谱确证了GOD得到成功表达。摇瓶发酵表明,2号转化子在微晶纤维素诱导92 h后,GOD酶活达到4.63 U/m L。该转化子的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和外切纤维素酶活分别为7.88 U/m L、2.58U/m L和0.84 U/m L,而出发菌株分别为6.79 U/m L、3.19 U/m L和0.57 U/m L,而β-葡萄糖苷酶由原来的0.66U/m L提高到1.65 U/m L(1.5倍)。实验表明,在里氏木霉中表达GOD能显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活,也能使总体纤维素酶活得到提高。     

水稻抗白叶枯病基因及其抗病机理的研究进展

水稻白叶枯病是由Xanthomonasoryzaepv．oryzae致病菌引起的全球性水稻病害。到目前为止,已有26个抗病基因被发现,有10个基因已在染色体上被定位,包括显性基因Xa1、Xa4、Xa21andXa26(t)等和隐性基因Xa5、Xa13等。对大部分抗病基因的抗病机制了解还不是很清楚。利用标记辅助选择(MAS)进行抗病育种是防治白叶枯病的有效途径。在此,综述了已发现的抗水稻白叶枯病基因的种类、分子标记、抗病机制和在抗病育种中的应用。     

曲霉型豆豉用高产蛋白酶菌种的选育

从曲霉型阳江豆豉曲中筛选出5株菌落形态不同的曲霉(Aspergillus spp.),通过纯种发酵制备豆豉曲,测定了豆豉曲中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的活性,从中筛选出1株蛋白酶活性较高的菌种,并对该曲霉进行ITS r DNA序列分析,发现该曲霉与Aspergillus oryzae strain P6B2(JX429926)的同源性最高,故鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae).以该米曲霉为出发菌株,通过紫外线诱变和硫酸二乙酯化学复合诱变处理,选育得到优良高产蛋白酶活性的突变株,其中性蛋白酶酶