苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

尾叶桉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、表达与单核苷酸多态性分析

【目的】通过获得尾叶桉Eucalyptus urophylla苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因序列,分析其在不同水肥处理下的表达模式及在尾叶桉群体中的单核苷酸多态性(SNP),为研究该基因与尾叶桉抗逆性的相关性提供基础。【方法】根据巨桉E.grandis的PAL基因序列设计引物,通过基因克隆、测序获得尾叶桉PAL基因序列;采用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析该基因在不同水肥处理下的表达模式。【结果】PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422和1 750 bp)和1 759 bp的内含子区域。PAL基因在AT4处理中表达量最高,在AT5处理中表达量最低。尾叶桉PAL基因与巨桉具有高度相似性。尾叶桉PAL基因的SNP位点主要集中在内含子区域,可见尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着稳定的遗传。【结论】获得尾叶桉PAL基因全长4 507 bp,该基因具有遗传稳定性,且可能在尾叶桉抗逆性中起重要作用。     

中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。     

青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因的克隆与表达分析

【目的】对青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因进行克隆及表达分析,为揭示其在青海湖裸鲤生长和生理过程中的作用奠定基础。【方法】采用PCR和RACE技术克隆青海湖裸鲤中TOB1和TOB2基因的cDNA全长序列,对其特性进行了生物信息学分析。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测TOB1和TOB2基因在3龄成鱼肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织及发育12,72,120,168,216 h胚胎中的表达水平。【结果】青海湖裸鲤TOB1 cDNA全长为1 734 bp,5′非编码区为466 bp,3′非编码区为296 bp,开放阅读框长972 bp,编码323个氨基酸。TOB2 cDNA全长为2 785 bp,5′非编码区为51 bp,3′非编码区为1 582 bp,开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸。TOB1和TOB2在N端均具有明显的BTG家族结构域,且系统进化分析显示2个TOB蛋白与鲤科鱼类同源性较高,亲缘较近。qRT-PCR结果表明,TOB1和TOB2在3龄成鱼的肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织中均有表达;TOB1在3龄成鱼的心脏组织中表达量最高,其次为脑和肌肉组织,在鳃组织中的表达量最低;TOB2在3龄成鱼的脑组织中表达量最高,其次为肌肉。TOB1及TOB2在不同发育时期胚胎中均有表达,且都在12 h胚胎中表达量最高。【结论】TOB1及TOB2在3龄成鱼各个组织及胚胎中均有表达,但表达量有较大差异,表明2个基因均具有时空表达特异性。     

杨树PsChiⅠ基因全长的克隆与表达分析

【目的】克隆川杨几丁质酶基因cDNA全长序列,分析其在病原菌侵染过程中不同时段的表达特征。【方法】以受落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)单孢子堆菌系Sb052侵染后的川杨叶片为试材,采用RACE法克隆川杨几丁质酶基因cDNA序列,对其进行生物信息学和实时荧光定量表达分析。【结果】克隆到1条川杨几丁质酶基因序列,将其命名为PsChiⅠ(GenBank登录号:KC416180)。该序列全长1 145bp,包含1段960bp的开放阅读框(ORF),38bp的5′非编码区和147bp的3′非编码区。其编码蛋白含有319个氨基酸,具有2条糖苷水解酶19家族特征序列,理论等电点为5.03,为ClassⅠb型酸性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。序列比对和系统进化树结果表明,PsChiⅠ与毛果杨(Populus trichocarpa)几丁质酶基因相似性最高,且亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,菌系Sb052侵染杨树叶片后PsChiⅠ基因在各个时段都有表达,但以侵染后12和48h时的表达量相对较高。【结论】获得了几丁质酶基因全长序列,推测其参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制。     

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

越橘VcANS基因的克隆及表达分析

【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶（ANS）基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘（Vaccinium spp.）品种“北陆”（V.corymbosum L.）为试材,并以Illumina测序文库（NCBI登录号：SRA046311）中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1 424 bp,包含93 bp的5′非编码区、248 bp的3′非编码区和1个长度为1 083 bp编码360个氨基酸的开放阅读框,该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2酮戊二酸和Fe²⁺依赖的氧化酶超家族的保守结构域。序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。在越橘果实发育的不同阶段,VcANS相对表达量的变化与花色素苷含量的变化趋势具有一致性。【结论】获得了越橘花色素合成酶基因全长,推测其对越橘花色素苷的形成起调控作用。     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702.VcCHS全长1438 bp,包含107 bp的5 ′非编码区、71 bp的3′非编码区和1个长度为1 260 bp编码419个氨基酸的开放阅读框.该基因编码的蛋白具有CHS家族普遍存在的功能活性位点:Cys(C)164、His(H)303、Asn(N)336和特征多肽序列(RLMMYQQGCFAGGTVLR).多重比对分析发现越橘VcCHS基因编码的氨基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)CHS基因编码的氨基酸序列相似性达90.2％.系统进化分析表明,该序列与杜鹃花目的植物聚为一类.VcCHS基因在果实发育的整个过程均有不同程度的转录表达,花期和果实成熟期表达量较高,绿果期表达量最低.VcCHS相对表达量变化与花色素苷相对含量的变化趋势具有一致性,并均在果皮组织中达到最高.     

二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析

从二色补血草中分离出2个金属硫蛋白基因的cDNA全序列,分别命名为LbMT1和LbMT2。LbMT1全长为569bp,其中5′非编码区23bp,3′非编码区300bp,开放读码框(ORF)长246bp,编码含81个氨基酸的蛋白,相对分子质量为8070,等电点为4.7;LbMT2全长为523bp,其中5′非编码区61bp,3′非编码区216bp,开放读码框长246bp,编码81个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为8000,等电点为5.0。这2个基因编码的氨基酸都含有14个半胱氨酸Cys,分布在蛋白质的N端和C端,呈CC、CXC和CXXC形式排列。疏水性分析表明:这2个蛋白都存在35~48个氨基酸之间较强的疏水区。通过对多种植物的MT蛋白序列比对分析表明,金属硫蛋白家族在氨基酸数目上保守性差,但半胱氨酸残基(Cys)的位置和数目保守性达到100%,揭示了Cys对金属硫蛋白的功能十分重要。这2个基因已经在Genbank上注册,LbMT1基因的登录号为EF103574,LbMT2基因的Genbank登录号为EF103575。     

PCR快速筛选棉纤维cDNA文库分离全长cDNA序列

建立了一种利用PCR-96孔板法快速筛选棉纤维cDNA噬菌体文库，分离全长基因序列的技术体系．首先根据已知EST片段设计一至两对特异PCR引物，通过在96孔滴定板上逐级稀释cDNA文库，利用特异引物以及特异引物与通用引物组合逐级从cDNA文库中筛选目标克隆，最终可获得目标全长cDNA。     

发育中棉纤维硫酸木质素含量的动态变化

[目的]比较发育中棉纤维硫酸木质素含量的动态变化。[方法]采用硫酸法测定发育中棉纤维木质素含量。[结果]单位棉铃硫酸木质素含量随棉纤维次生壁的增厚呈递增趋势,海岛棉硫酸木质素含量总体低于陆地棉。棉纤维硫酸木质素含量的动态变化呈"S"型曲线,棉纤维硫酸木质素含量变化符合Logistic函数,陆地棉硫酸木质素含量快速累积时期持续的时间长于海岛棉,但单位棉铃硫酸木质素含量最大累积速率出现的时间要晚于海岛棉,而陆地棉单位棉铃硫酸木质素最大累积速率(V_(max))与海岛棉间没有显著差异。[结论]海岛棉与陆地棉相同发育时期内的硫酸木质素含量差异显著。     

基于CBERS-02卫星遥感图像海岛棉与陆地棉植被指数的对比

随着遥感技术的发展,植被指数作为用来表征地表植被覆盖和生长状况的度量参数,已经在环境、生态、农业等领域有了广泛的应用。本文利用中巴资源卫星CBERS-02星CCD1-5波段遥感图像,比较了海岛棉与陆地棉5种植被指数(比值植被指数RVI,归一化差异植被指数NDVI,红色植被指数R I,转换型植被指数TVI,归一化差异绿度指数NDG I)的差异。结果表明:海岛棉与陆地棉的5种植被指数差异均未达到显著性水平(P>0.05);海岛棉与陆地棉之间比值植被指数RVI差异最大,而转换型植被指数TVI差异最小;在阿拉尔垦区利用7月份CBERS-02卫星遥感图像植被指数的差异很难区分出海岛棉与陆地棉。     

Quantitative Trait Loci for Resistance Against Fusarium Wilt Based on Three Cotton F2 Populations

Fusarium wilt （FW） is one of the most common cotton diseases in the world. Identification of QTLs conferring resistance to FW is key for the incorporation of resistance genes into elite cultivars. Two intraspecific （cross between Gossypium hirsuturn L.） and one interspecific （cross between Gossypium hirsutum L. and Gossypium bardence L.） F2 populations were constructed by using a highly resistant cultivar and crossing it to a susceptible cultivar with 154, 79, and 148 offsprings, respectively. Simple sequence repeats （SSR） were used to screen genomic regions closely linked to FW resistance. The results showed that five QTLs associated with FW resistance were detected in two intraspecific populations using a composite interval mapping method under four different conditions. Four of these loci located on Chr. 2/Chr. 17 neighboring markers JESPR304 or CIR305 which explained 13.1 to 45.9% of the phenotypic effect. Furthermore, JESPR304 and CIR305 were previously testified and found to be tightly linked. It is possible that these four QTLs detected under different conditions were the same resistance QTL/gene. We consider that there is the possibility of a major FW resistant gene in intraspecific populations. In the interspecific mapping populations two QTLs were detected on Chr. 9 and Chr. 12/26 which explained great phenotypic variance of 49.4 and 45.7%. As the location of QTLs for FW resistance among the intraspecific and the interspecfic populations were totally different, it is suggested that there may be different resistance mechanisms between G. bardence L. and G. hursutum L. Thus, the present research provides an opportunity to understand the genetic control of resistance to FW in Gossypium hirsutum and Gossypium bardence and to conduct MAS in breeding programs to develop FW resistant cultivars.     

棉花亲环素基因GhCYP2的克隆及实时定量表达分析

【目的】分离棉花中的亲环素基因。亲环素基因是一类多基因蛋白质家族,广泛存在于高等植物各个组织和器官中,参与多种重要的生理生化过程。【方法】以小麦亲环素wCyP3基因蛋白序列(AF262984)为探针序列,在GenBank中与棉花EST序列进行tBLASTn比对,将同源性高的EST序列拼接后获得一条长912 bp的cDNA序列。【结果】序列分析表明,该cDNA含有一个编码174个氨基酸的开放阅读框,基因的编码产物为亲环素蛋白,将该基因命名为GhCYP2(GenBank登录号:JN032296)。采用Clustal X将GhCYP2的氨基酸序列与其他生物亲环素氨基酸序列进行相似性比对,发现与水稻、拟南芥等生物的相似性较高,达到80%以上。利用实时荧光定量PCR技术分析了GhCYP2在棉花各个组织器官中的表达模式,检测结果显示:GhCYP2在棉花叶及18DPA棉纤维中的表达量最高,在根、茎、花、3～15DPA、21～30DPA棉纤维中均有适量表达。【结论】推测GhCYP2可能在棉花纤维伸长至次生壁合成的重叠期发挥着信号传导作用。     

陆地棉叶绿体基因组密码子使用偏性的分析

 【目的】通过分析陆地棉叶绿体基因组密码子使用偏性,探讨影响密码子偏性形成的主要因素。【方法】以陆地棉叶绿体基因组为研究对象,利用Mobyle及其它软件,分析叶绿体50个基因密码子的使用模式。【结果】陆地棉叶绿体基因组密码子GC1与GC2之间的相关系数达到极显著水平,GC3含量最低,与GC12的相关系数为0.14,双尾检验未达到显著水平;单个基因ENC比值多分布在-0.05—0.05;对应性分析,第一轴上显示了10.27%的差异,与GC3、ENC的相关系数分别为0.223和-0.147,均未达到显著水平。【结论】陆地棉叶绿体密码子第三位偏好使用嘧啶,而最优密码子多以A或T结尾;密码子使用模式可能是由选择和突变及其它因素共同作用形成的。     

海岛棉染色体片段代换系BC_4F_4产量及纤维品质主成分分析

利用生产上大面积推广种植的陆地棉中221和品质优良的海岛棉栽培品系海1杂交,并与陆地棉中221回交再连续自交,结合SSR分子标记技术建立一套具有陆地棉背景并渐渗有海岛棉基因的染色体片段代换系。试验对BC4F4株行的产量及纤维品质相关性状进行表型主成分分析,结果表明:其产量性状间、纤维品质性状间存在难以调和的矛盾,产量性状与品质相关性状之间的遗传相关通过铃重与棉纤维长度的关系体现出来。     

棉花和小叶杨小孢子母细胞中超数核仁的形成及动态变化

用光镜和透射电镜观察研究了棉花(Gossypium hirsutum)和小叶杨(Populussimonii)小孢子母细胞中超数核仁的发生和动态变化过程。超数核仁出现于减数分裂前(棉花)和减数分裂前期Ⅰ早期(小叶杨),产生部位是核仁组织者区域。超数核仁与主核仁有类似的染色特性,但体积小,数量丰富。在小孢子母细胞减数分裂过程中,超数核仁通过下述主要方式进入细胞质:一是在分裂中期和后期核膜暂时解体时进入细胞质中;另一是在核膜完整时通过状态的变化经核膜孔进入细胞质或以整体形式通过核膜外突并缢出进入细胞质中。小孢子母细胞中超数核仁的发生可能是大量迅速补给细胞质核糖体数量的一种机制,与孢子体转向配子体的发育有关。     

陆地棉中长绒杂种优势的研究

1991年在北京对两个陆地棉中长绒杂交组合、一个一般陆地棉杂交组合和两个陆海杂交组合 F_1的研究表明:陆地棉中长绒杂交种可以把高产和优质有机地结合在一起,其皮棉产量超过陆地棉对照品种中126%和3%,纤维长度、细度和强度仍保持中长绒亲本水平,基本接近陆海杂交种的各项指标。     

陆地棉中长绒杂种优势的研究

近年来,利用基因生物技术并结合常规育种对植物进行改良的研究,在创造新品种和新材料等领域发挥了重要作用。利用 Ti 质粒的 T—DNA 系统,应用于双子叶植物得到了一些抗虫、抗除草剂的植物。但由于农杆菌难以侵染单子叶植物,使 Ti 质粒系统在禾谷类作物改良上得到很大限制。为此发展了外源基因导入技术,即通过不同途径,把外源基因或 DNA 片段直