橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库的构建与EST测序分析

 【目的】构建橡胶树胶乳均一化全长cDNA文库,降低胶乳中存在的高丰度表达基因的拷贝数,提高胶乳表达基因的分离鉴定和EST测序分析效率。【方法】以橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳为材料,将胶乳全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了橡胶树胶乳的非剪切型全长cDNA原始文库,经检测原始文库的滴度为6.0×106 cfu/mL,平均插入片段长度大于1.5 kb,重组率约为100%,全长cDNA比例约为76%;利用基因组DNA饱和杂交技术对胶乳原始cDNA文库进行均一化处理,构建橡胶树胶乳的均一化全长cDNA文库。【结果】胶乳均一化全长cDNA文库的总库容量(总CFU)为1.87×105,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,橡胶树胶乳2个高丰度表达基因,即小橡胶粒子蛋白(SRPP)和橡胶延长因子(REF)基因,在均一化cDNA文库中的表达量均下降了约1 000倍。【结论】构建了均一化效果良好的橡胶树胶乳全长cDNA文库,并对文库中随机的12 000个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressed sequence tag)序列为11 951条,经拼接共获得单一基因(unigene)为3 394个,其中包括片段重叠群(contig)2 061个和单一EST序列(singlet)1 333个。此cDNA文库将可用于橡胶树功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及橡胶树胶乳cDNA芯片的制备。     

亚洲棉（Gossypium arboreum L.）全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定

 【目的】构建二倍体亚洲棉石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库，建立亚洲棉功能基因组学研究基础平台，发掘亚洲棉发育、抗逆等相关基因。【方法】取石系亚1号子叶期、苗期、蕾期、花铃期不同组织器官，提取总RNA并分离纯化mRNA，采用SMART技术反转录全长双链cDNA。用DSN（duplex-specific nuclease）法对全长双链cDNA进行均一化，均一化的cDNA连接到λZAPⅡ载体，包装蛋白包装后构建石系亚1号全生育期均一化全长cDNA文库。【结果】初级文库滴度4×106 pfu?ml-1，库容2×106个独立克隆，重组率大于95%，插入片段平均长度大于1.5 kb。随机挑取192个克隆进行EST（expressed sequence tags）测序，冗余度仅为3.49%。BLASTN比对结果显示：78.31%的EST为新EST。【结论】文库均一化效果良好，质量符合要求，可能包含大量新基因，是进行EST测序、发掘新基因等棉花功能基因组学的研究平台。     

冀228纤维均一化全长cDNA文库的构建与鉴定分析

【目的】构建优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,降低纤维中存在的高峰度基因的拷贝数,提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。【方法】以优质陆地棉冀228开花后8—40 d纤维为材料,将纤维全长cDNA与Gateway供体载体p DONR222重组,构建了棉花纤维的非剪切型全长cDNA原始文库。利用均一化技术获得均一化全长cDNA文库,进而测序获得大量的EST序列。采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接、比对、COG功能注释和GO注释。【结果】构建了优质陆地棉冀228纤维均一化全长cDNA文库,该文库初级文库库容为1.06×107,初级文库的滴度为3.56×106 cfu·m L-1,平均片段长度为1.2 kb。q RT-PCR检测均一化程度结果表明,棉花2个高峰度表达基因在该文库中的表达量均下降了1 000倍。随机选取2 384个克隆进行单向测序,获得2 169条高质量的表达标签(EST),拼接成1 745个单一基因(Unigene);同源比对分析表明,70%的Unigenes与已知功能基因具有较高的同源性。基因进行COG功能分类结果显示,较多的COG功能分类集中在"翻译、核糖体结构和生物转化"、"碳水化合物运输与代谢"和"翻译后修饰、蛋白转移及蛋白伴侣"功能上。根据基因的GO注释结果,参与细胞构成、细胞器和膜构成的基因比例最高,参与细胞过程和新陈代谢等过程的基因比例较高,具有结合和催化功能的基因较多,这些基因可能在棉纤维发育中发挥比较重要的作用。【结论】构建了优质陆地棉栽培品种冀228纤维均一化全长cDNA文库,经文库质量检测、均一化程度检测和随机选取克隆的测序分析结果表明,文库的代表性和重组片段的完整性均达到了分离筛选目的基因的建库要求,整个文库有着很高的非冗余性。构建的cDNA文库具有既能获得与已知序列同源性很高的基因,又能挖掘出优质陆地棉冀228特有的基因或同源序列的作用,能够提高发现纤维发育相关基因随机序列和稀有基因的效率,将为公共数据库提供丰富的陆地棉EST资源。     

我国cDNA文库研究现状

cDNA文库是研究基因组学的基本手段之一，它便于克隆和表达，可以从中筛选所需的目的基因，并直接用于该基因的表达，我国cDNA文库研究虽然起步晚，但发展很快，目前已成为克隆基因、表达基因的重要途径。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

均一化cDNA文库的研究进展及其应用（摘要）

均一化cDNA文库是可获得表达序列标签和发现基因的一个新的有效平台。它降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度,提高了发现随机序列和稀有基因的效率。本文综述了构建均一化cDNA文库的原理,步骤及其在植物和动物中的应用,以期可促进均一化cDNA文库的发展和它在发现新基因中的应用。     

cDNA文库构建策略及其在盐生植物中的应用

构建各种cDNA文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法。cDNA文库主要包括cDNA全长文库、cDNA差减文库和cDNA均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同。近年来,通过构建各种cDNA文库、获得大规模高质量EST数据库,并在此基础上分离克隆抗逆相关基因已经成为研究植物耐盐机理的重要途径。旨在对cDNA文库的主要类型及其构建策略,以及cDNA文库在盐生植物新基因筛选中的应用进行综合论述,并对植物耐盐机制的研究提出了展望。     

白色青年羊驼皮肤的基因表达分析

 【目的】研究羊驼皮肤功能发生的规律和机理以及发现新的功能基因。【方法】用SMART技术构建白色青年羊驼皮肤cDNA文库，随机挑取13 800个克隆进行规模测序。预处理后，获取高质量的表达序列。用CAP3对高质量序列进行拼接;BLAST对拼接序列进行同源比较，以注释功能;CLUSTER对已知序列进行聚类;根据标准基因词汇体系，并结合人组织基因表达谱分类标准，对具有注释信息的基因聚类进行分类，构建羊驼皮肤的基因表达谱。【结果】cDNA文库库容量达106PFU，从中获得高质量序列7 286条（在GenBank中命名为ASCD）。拼接成5 837条一致性序列，包括446条重叠群和5 391条单一序列。1 732条无相应注释，被认为是新基因。聚类成4 968个单基因簇（Unigene）。该基因表达谱最显著的特点是代表基本转录和翻译系统以及细胞骨架结构的转录本的表达丰度处于最高水平，原胶原I型（Procollagen typeI）等单个基因表达丰度处于较高水平。此外，还发现可能与羊驼毛质量、生长和毛色相关的基因。【结论】首次构建了羊驼皮肤cDNA文库和基因表达谱;获取的大量基因信息反映了青年期白色羊驼皮肤的生理特性和功能;该文库的构建是有效地发现新基因的理想资源。     

cDNA文库在棉花基因发掘中的应用

构建cDNA文库是发掘基因和研究基因功能的重要工具,也是基因组学研究的重要技术手段。棉花作为世界上重要的经济作物之一,研究人员已经构建了大量的棉花cDNA文库,为棉花基因发掘和功能研究积累了丰富的Expressed Sequence Tags(ESTs)资源。本文对近几年来cDNA文库在棉花基因发掘中的应用进行了总结。     

草莓果实cDNA文库的构建及鉴定

草莓是研究果实发育的模式植物。基因表达谱分析已成为目前分子生物学领域重要的研究方向。草莓cDNA文库构建是研究果实发育基因表达的基础工作。本研究从草莓白果中提取高质量的总RNA,通过MMLV反转录酶的作用,把RNA中的mRNA反转成cDNA第一链,再利用特异引物通过LD-PCR扩增合成双链cDNA。将纯化带有黏性末端的双链cDNA与λTrip I Ex2载体进行连接,最后对重组载体进行E.coli XL1-Blue体外包埋为cDNA原始文库。经过鉴定,原始文库的滴度为1.13×10-7 cfu/mL,重组率为100%,插入片段多分布在0.2~2.0kb之间,表明构建的草莓果实cDNA文库质量较高,能够满足后续的分子生物学研究工作的需要,同时也为其他果树相关研究提供借鉴。     

cDNA文库构建及其在植物抗性研究中的应用

cDNA文库是指生物不同生长发育时期特定组织或器官所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA与栽体连接后形成的克隆的集合,cDNA文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、组织和发育时期基因表达的前提和基础.笔者就近年来cDNA文库的构建及其在植物抗性研究中的应用作一综述.     

凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建

【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息，为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库，并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明，初始文库库容约8．50×10^6 CFU，重组率在95％左右，插入片断大小为0．5～4．0kb，多数在1．0kb以上。随机测序72条cDNA，可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过Gene Ontology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类，其中蛋白质合成类基因最多（27．03％），与细胞骨架（13．51％）、细胞信号传导（13．51％）及代谢类基因（13．51％）共占67．56％。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库，可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息.     

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

 【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库，并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA，采用oligo（dT）引物合成双链cDNA，并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体，并用之转染大肠杆菌ER1647，从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆，经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库，其初级库容量约为1.0×106 PFU，扩增文库的滴度为8.2×108 PFU?ml-1，文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析，共获得30个新基因，其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原，以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。