O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

[目的]通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持.[方法]以O型FMDV VP1全基因重组质粒pMD18-T-T-VP1及串联的ⅥP1多表位基因重组质粒pMD 18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒pET-32a-VP1和pGEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211 (DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定.[结果]O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性.[结论]表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发.     

非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果

【目的】口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)的传染性强,传播广,给世界经济和社会发展带来巨大危害,目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的,基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究,对非致病性大肠杆菌鞭毛进行修饰,研究鞭毛蛋白(flagellin,F)以及有无LTMT佐剂不同重组鞭毛蛋白对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse,FMDV)的佐剂作用。【方法】通过体外表达获得pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pCold-F0NC、pCold-F0NC-LTMT 4种不同重组鞭毛蛋白,用间接ELISA方法检测pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT蛋白的生物学活性,按照5μg/只小鼠蛋白量与FMDV灭活抗原混合制备疫苗,同时设置添加或者不添加ISA 206佐剂组,皮下接种Balb/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采血并采集小鼠粪便,45 d后取小肠后段,采用阻断ELISA方法检测血清IgG抗体滴度,用间接ELISA方法检测小鼠粪便和肠洗液中特异的分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)抗体滴度,以评估免疫效力。【结果】SDS-PAGE和Western blot分析表明,4种不同重组鞭毛蛋白成功表达。并用GM l-ELISA方法验证了pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT的生物学活性,融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了与GM l结合能力。动物试验结果表明,疫苗经皮下注射接种后,单独口蹄疫抗原组没有产生明显的抗体水平,而鞭毛蛋白佐剂组比单独的口蹄疫抗原组,IgG滴度高,并且产生sIgA抗体滴度更早、更高。此外,LTMT与鞭毛蛋白协同作用能刺激小鼠机体产生更高的IgG和sIgA。在试验中,当鞭毛蛋白与ISA 206佐剂联合使用时,血清中IgG滴度大幅增高,且抗体持续期延长。口蹄疫抗原与ISA 206佐剂和F0NC-LTMT混合使用效果最佳,显示对FMDV的最好保护。【结论】数据表明,黏膜佐剂F0-LTMT发挥双重佐剂活性,皮下注射可显著提高FMDV全身特异性IgG和局部sIgA水平,显示其具有良好的应用前景。     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB基因融合表达产物的免疫应答

[目的]为预防口蹄疫与幼畜腹泻、生产安全高效的基因工程联合疫苗提供试验依据。[方法]通过基因工程技术,把O型口蹄疫病毒VP1双拷贝21-40(20aa)与141-160(20aa)表位肽基因——2020VP1与产肠毒素大肠杆菌LTB连接到表达载体上,在大肠杆菌中表达出具有抗O型口蹄疫病毒与产肠毒素大肠杆菌双重作用的融合蛋白。[结果]运用基因工程技术构建了融合表达载体r2020-B-2020。转化宿主菌BL21(DE3)RIL后的表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示,重组融合蛋白的分子量约为41 kD,表达量较高。动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的抗FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白可以诱导机体产生有效的抗FMDV细胞及体液免疫反应。融合蛋白能够与霍乱毒素CTB抗体特异结合,免疫雌鼠能够抵抗一定强度的大肠杆菌毒株攻击。[结论]融合蛋白可以同时诱导机体产生较好的抗FMDV及ETEC免疫应答反应,具有开发成为FMDV与ETEC基因工程疫苗的应用价值。     

犬埃立克体多表位融合抗原蛋白的免疫学特性研究

【目的】构建和制备具有较强抗原性的犬埃立克体(Ehrlichia canis)重组蛋白并研究其免疫学特性。【方法】利用ABCpred等在线软件预测分析犬埃立克体gp19、gp140和gp200等蛋白的优势线性抗原表位,构建多表位融合抗原基因E.canis-megp19及E.canis-megp-1,经PCR扩增后将其克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-E.canis-megp19和pET-32a(+)-E.canis-megp-1,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后转化至感受态细胞大肠杆菌BL21 (DE3)中,优化表达条件(IPTG诱导浓度、温度及时间),表达重组蛋白后检测其免疫原性。【结果】成功构建并合成了多表位融合抗原基因E.canis-megp19和E.canis-megp-1,其PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳后分别出现大小为414和429bp的片段;重组载体pET-32a(+)-E.canis-megp19和pET-32a(+)-E.canis-megp-1双酶切后得到了预期长度的目标片段;SDS-PAGE结果显示,当加入1.0mmol/L IPTG、37℃诱导8h后,E.canis-megp19及E.canis-megp-1重组蛋白均可大量表达,其分子质量分别为38和39ku;Western blot分析显示,该重组蛋白可被犬埃立克体阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验表明,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体。【结论】制备的多表位融合重组蛋白能够高效地在大肠杆菌中表达且能够诱导机体产生特异性抗体。     

猪O型口蹄疫病毒抗原表位/VP1蛋白的融合表达及免疫原性研究

目的 获得可稳定表达猪O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)抗原表位融合结构蛋白VP1的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO-K1),制备亚单位疫苗。方法 设计合成含FMDV抗原表位与VP1基因序列的重组基因RP1,将其克隆到表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中,将构建的重组质粒与辅助质粒PLP1、PLP2和PLP3共转染HEK-293T细胞,获得重组慢病毒HIV-RP1;将收获的病毒液感染CHO-K1细胞,经筛选获得单克隆细胞株,通过间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定,获得可表达RP1的阳性细胞株,命名为CHO-K1-RP1;将CHO-K1-RP1连续传30代,每隔5代收获相同数量的细胞样品进行Western blot鉴定。结果 IFA结果显示,表达RP1的细胞发出绿色荧光,而空白对照无绿色荧光;Western blot结果显示,在约55 kU处能观察到清晰的条带;表明成功获得了融合蛋白。将获得的融合蛋白与佐剂等体积混合制备成亚单位疫苗免疫BALB/c雌鼠,抗体检测结果显示,二次免疫后,该亚单位疫苗组与口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)商品化灭活疫苗组小鼠之间抗体水平无显著差异,两者抗体水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论 本研究构建的亚单位疫苗能有效刺激小鼠机体产生免疫应答反应,为猪口蹄疫新型疫苗的研制提供了参考。     

犬ELF4基因原核表达及其卵黄抗体的制备

【目的】克隆犬转录因子ELF4基因（cELF4）,体外表达重组cELF4蛋白（rcELF4）并制备抗该蛋白的卵黄抗体（IgY）,为深入探究犬ELF4蛋白功能提供基础材料。【方法】采用RT-PCR扩增cELF4基因,将目的基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒并测序,运用生物信息学软件分析其核苷酸序列及编码的氨基酸序列特征。将cELF4基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET28a-cELF4,分别转化大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。将rcELF4蛋白分别与3种免疫佐剂（ISA 15AVG、 ISA 71VG、 ISA 201VG）乳化制备免疫原,通过免疫蛋鸡检测抗体滴度和IgY含量。构建真核重组表达载体pEGFP-cELF4,转染细胞后,利用免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）分析cELF4特异性IgY的免疫活性。【结果】cELF4基因（GenBank登录号MZ198105）的开放阅读框（ORF）为1992 bp,编码663个氨基酸残基。cELF4基因与狐ELF4基因的核苷酸相似性最高 （99.3%）,而与小鼠的相似性最低 （81.5%）。结合系统进化结果发现, cELF4基因与狐、大熊猫、欧洲雪貂、北美水獭等动物ELF4基因的亲缘关系较近,而与人和猴等灵长类动物及啮齿类鼠ELF4基因的亲缘关系相对较远。rcELF4蛋白分子量大小约100 kD,可刺激鸡产生相应抗体, ISA 15AVG、 ISA 71VG和ISA201VG组血清抗体滴度均在首免后38 d达峰值,其中ISA 201VG组效价最高 （>128000倍）,且3组rcELF4特异性IgY抗体均在首免后14 d转阳,首免后35 d达峰值,其中ISA 201VG组血清抗体滴度最高,为256000倍。3组鸡蛋卵黄中所提取的IgY含量最高值为4.09 mg/10 mL卵黄液,与rcELF4蛋白呈特异性反应、且与人ELF4蛋白存在交叉反应。rcELF4蛋白定位在细胞核。【结论】 rcELF4蛋白在大肠杆菌中成功表达,且存在翻译后修饰现象,不同类型的免疫佐剂对rcELF4蛋白的免疫原性产生不同的影响,所制备rcELF4抗体免疫活性良好,且与人ELF4蛋白存在交叉反应。     

胸膜肺炎放线杆菌毒力因子重组蛋白免疫原性研究

【目的】研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)重组亚单位疫苗的免疫保护效果。【方法】用1.0mmol/LIPTG诱导重组表达质粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1,SDS-PAGE鉴定。纯化的表达产物通过Western blot分析有较好的免疫原性。将rApxⅠ、rApxⅢ和rOmp组合作为疫苗Ⅰ组,rApxⅠ、rApxⅢ、rOmp和灭活菌苗组合作为疫苗Ⅱ组,APP 1、3、7型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBSⅣ作为空白对照组,进行家兔的免疫试验。免疫共分2次,每次间隔2周。【结果】疫苗Ⅱ组的抗体水平均显著高于疫苗Ⅲ组,疫苗Ⅰ组抗体水平不如疫苗Ⅲ组,其血清效价最高滴度为1∶256。【结论】猪传染性胸膜肺炎毒力因子重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究新型亚单位疫苗奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定

为构建并表达O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的空衣壳蛋白的重组杆状病毒并鉴定其抗原性.以质粒pMD19-P12A3C为模板,扩增出编码O型FMDV衣壳蛋白前体P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因,插入至杆状病毒转移载体pFast-BacDual PH启动子下,构建出重组转移载体pFastBacDual-P12A3C,并转化DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,构建重组转座子Bacmid-P12A3C,将其转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C.增殖重组杆状病毒然后用其感染Sf9细胞,最后通过间接免疫荧光检测外源蛋白的表达.结果表明,表达产物能够被O型FMDV VP1多克隆抗体识别,并具有良好的反应原性,表明表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒rBac-P12A3C构建成功.该研究为进一步研究O型FMDV空表壳的体外组装提供前期实验材料,并为后期研制出口蹄疫的基因工程亚单位疫苗奠定基础.     

MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强效应

【目的】探讨单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A,MPLA)对口蹄疫(food and mouth disease,FMD)O型灭活疫苗的免疫增强效应,提高口蹄疫灭活疫苗的免疫效果.【方法】通过检测MPLA刺激脾脏细胞的增殖情况和刺激DC后成熟及吞噬能力的大小,对MPLA的体外免疫刺激效应进行评价;将MPLA与ISA 206和灭活FMDVO型抗原配制疫苗后免疫小鼠,通过检测抗体水平、T细胞亚群、抗原特异性淋巴细胞增殖及浆细胞的比例,评价MPLA对口蹄疫O型灭活疫苗的免疫增强作用.【结果】MPLA体外可刺激B淋巴细胞增殖,上调DC表面共刺激分子的表达,使其吞噬能力减弱;制备疫苗免疫小鼠,血清抗体水平检测发现,MPLA组在7、14 d时抗体水平显著高于ISA 206组,且其抗原特异性的B淋巴细胞增殖,外周血中CD19~+CD27~+CD38~+浆细胞的比例也显著高于ISA 206组.【结论】MPLA通过促进B淋巴细胞的增殖与活化增加了抗体的产生,增强了小鼠对口蹄疫疫苗的免疫应答能力,证实MPLA是口蹄疫疫苗的良好候选免疫佐剂.     

利用霍乱毒素B亚单位展示猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位

为探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备口蹄疫亚单位疫苗的可行性,利用E.coli表达CTB-GHloop嵌合基因,用SDS-PAGE分析目的基因的表达及表达产物的可溶性,利用神经节苷脂(GM1)为抗原鉴定重组蛋白五聚体的形成。将目的蛋白浓度调整为200μg/ml,以白油佐剂乳化制备疫苗,免疫健康仔猪,免疫后利用ELISA测定特异性抗体水平,评价免疫后体液免疫反应,利用淋巴细胞增殖实验评价细胞免疫水平。结果表明嵌合基因在E.coli中获得高效表达,重组蛋白可溶,并能够形成五聚体;Western-blot结果显示重组蛋白能够与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生反应;以每头仔猪200μg免疫,试验猪产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。     

《河北农业大学学报》创刊年代考

清光绪二十八年(1902)河北农业大学前身—直隶农务学堂诞生,经几易其名,于1958年更名为河北农业大学至今。清光绪三十一年(1905)直隶高等农业学堂时期创办了《北直农话报》,清光绪三十四年(1908)更名为《直隶农务官报》,中华民国七年(1918)改出《农学月刊》,中华民国十七年(1928)易名为《河大农刊》,中华民国二十三年(1934)更名为《河北通俗农刊》,中华民国二十四年(1935)易名为《河北农林学刊》,1948年更名为《河北农学院研究专刊》,1959年更名为《河北农业大学学报》至今。《河北农业大学学报》前身诸刊都与现时的《河北农业大学学报》有着一脉相承的历史渊源,各刊之间联系紧密,连续性、继承性强。因此,《河北农业大学学报》的创刊时间应追溯至1905年创办的《北直农话报》。     

浅谈饲料中有效能的测定技术

饲料中有效能是供动物生长发育的基础.不同动物所用的有效能体系不同,目前大多数动物采用消化能、代谢能体系,但随着研究的发展与深入,发现最能反映饲料有效能的是净能体系.无论哪种体系,采用合理的测定技术准确测定饲料中的有效能值显得尤其重要,通过对饲料有效能值的准确测定可以实现动物所需能量的精确供给,减少养殖成本,使经济效益最大化.文章综述了几种有效能评价体系的测定技术.     

山茱萸多糖提取工艺优化及马钱苷含量测定

采用L（934）正交设计试验,对山茱萸浸提液中山茱萸多糖的酶水解法提取工艺进行了优化研究,并对浸提液的中有效成分马钱苷含量进行了HPLC法分析。结果表明,山茱萸多糖浸提的最佳工艺为：液料比1∶5,浸提时间4 h,浸提温度80℃,果胶酶添加量0.55 g/L。用HPLC法测定出的山茱萸浸提液中马钱苷平均含量为0.512 ...     

生态旅游潜在客源市场特征的调查研究--以湖南永州金洞森林旅游开发为例

为探明客源市场生态旅游消费的潜在特征，采用问卷调查的形式，就长沙市居民对湖南金洞生态旅游开发的意向等问题进行抽样调查．结果显示，生态旅游符合人们“回归自然”的旅游新时尚，有着极大的开发空间，指出生态旅游的开发要注重环境保护和可持续发展．开发的产品要以休闲度假类的大众产品为主，开发生态旅游都市客源市场还要多种渠道并用，尤其是要注重媒体的宣传．     

高校贫困生认定工作面面观

国家贫困生资助政策实施以来,对贫困生帮助很大,同时在实际运行中还存在着一些问题。本文提出贫困生认定工作仍需要进一步采取各种相关配套措施,以推动和保障贫困生资助工作更好地开展。     

施用SODm增效剂对水稻干物质积累及肥料利用率的影响

通过设置不同SODm增效剂施肥量梯度,研究SODm增效剂对提高肥料利用率和水稻干物质积累与转换的影响,结果表明SODm增效剂分别较普通肥处理和复混肥处理可显著提高肥料利用率6.8%和5.04%。施用SODm增效剂可以显著提高水稻抽穗前后干物质生产,以及抽穗后物质转运效率,相对于普通肥处理增产8.4%。     

水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的纯化技术

应用萄聚糖凝胶柱层析对水牛梭形住肉孢子虫包囊包溶性抗原进行了纯化。结果表明：纯化水牛梭形住肉孢子虫包囊抗原的最适条件为：选用萄聚糖凝胶Ｇ—１００柱层析系统；洗脱液为０３ＭＰＢＳ（ｐＨ７２），床体积为１０ｃｍ×１６５ｃｍ，上样体积为５００ＨＬ；流速为１２ｍＬ／ｈ。纯化抗原可使琼脂凝胶双扩散试验的阳性检出率提高３０％。     

黑豆不同部分馏油的体外抗氧化性比较

[目的]通过体外抗氧化体系比较黑豆不同部分馏油抗氧化性活性。[方法]通过正交试验优化索氏提取黑豆馏油的最佳工艺,提取黑豆不同部分馏油;研究黑豆不同部分馏油对羟基自由基(·OH)、DPPH自由基(DPPH·)的清除能力。[结果]在样品浓度为1.0 mg/mL时,黑豆不同部分馏油对·OH的清除率分别为全豆馏油83.9%、豆黄(黑豆去皮部分)馏油64.8%、豆皮馏油17.3%,对DPPH·的清除率分别为全豆馏油41.3%、豆黄馏油33.2%、豆皮馏油77.9%。[结论]黑豆不同部分馏油均具有较好的抗氧化性,是良好的天然抗氧化剂。黑豆不同部分馏油对·OH的清除能力从大到小依次为全豆馏油、豆黄馏油、豆皮馏油,对DPPH·的清除能力从大到小依次为豆皮馏油、全豆馏油、豆黄馏油。     

姬松茸碳源利用规律的研究

试验采用麦秸培养基,系统研究了姬松茸在生长期间对碳源的利用规律。结果表明,姬松茸降解的有机物质绝大部分被菌体的呼吸过程消耗掉,绝对生物学效率较低;在菌丝生长阶段,木质素的降解速率大于纤维素和半纤维素,这对纤维素和半纤维素的降解十分有利;非木质纤维素组分在菌丝生长阶段被主要利用,而木质纤维素则是子实体生长阶段的主要碳源。且就整个栽培过程而言,姬松茸生长发育所需要的79.86%的碳源来自木质纤维素。     

Exploration of Scientific Methods of Storage of Chestnut

板栗属壳斗科栗属(Castanea mollisima Blume),其种子属于顽拗型种子,不耐贮藏.基于近年来板栗贮藏保鲜技术研究成果,从合理采收、贮前处理、贮藏方法等方面进行论述.