无乳链球菌感染吉富品系尼罗罗非鱼的病理学研究

[目的]确定无乳链球菌侵染吉富品系尼罗罗非鱼的途径及靶器官,为罗非鱼抗病育种及无乳链球菌病疫苗的研发提供理论依据.[方法]分别采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式对吉富品系尼罗罗非鱼进行无乳链球菌感染,然后采集感染罗非鱼的鳃、脾脏、肝脏和小肠组织进行病理形态学观察,并利用家兔抗无乳链球菌血清进行免疫组织化学定位,明确不同感染途径下无乳链球菌在鱼体内各组织中的分布规律及其浸染的靶器官.[结果]3种人工感染方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其中,腹腔注射和经口灌胃在感染2h后即出现病理变化,而体外浸泡感染方式出现病理变化的时间约在感染5h后,且病变程度较腹腔注射和经口灌胃的感染方式轻.免疫组织化学定位发现,腹腔注射组吉富品系尼罗罗非鱼的病原菌信号出现顺序为脾脏→肝脏和鳃→小肠,经口灌胃组的病原菌信号出现顺序为小肠→鳃和脾脏→肝脏,体外浸泡组的病原菌信号出现顺序为鳃→脾脏→肝脏和小肠.[结论]采用腹腔注射、经口灌胃及体外浸泡3种方式均能促使吉富品系尼罗罗非鱼感染无乳链球菌,其对应的病原菌信号分别优先在脾脏、肠道和鳃组织出现.因此,自然养殖条件下防止养殖水体和食源被无乳链球菌污染是防控罗非鱼无乳链球菌病暴发的有效措施.     

吉富罗非鱼组蛋白酶B基因克隆及无乳链球菌感染后的表达分析

【目的】探究组蛋白酶B基因（CtsB）在吉富罗非鱼感染无乳链球菌前后的表达差异,为深入研究罗非鱼抗无乳链球菌感染的免疫应答机制及后续通过SNP分子标记/基因组编辑技术快速获得吉富罗非鱼抗病新品种提供科学依据。【方法】通过RACE克隆罗非鱼CtsB基因cDNA全长序列,使用SMART、 Splign、 MEGA v6.0、 BoxShade及MegAlign等在线软件进行生物信息学及系统进化分析,并以实时荧光定量PCR检测吉富罗非鱼CtsB基因组织表达谱及无乳链球菌感染后CtsB基因的表达变化规律。【结果】吉富罗非鱼CtsB基因cDNA序列全长1746 bp,包括161 bp的5'端非编码区（5'-UTR）、 592 bp的3'端非编码区（3'-UTR）及993 bp的开放阅读框（ORF）,共编码331个氨基酸残基。基于CtsB氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼的亲缘关系最近,而与鲤鱼、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鳎等物种相距较远。CtsB基因在吉富罗非鱼的肝脏、脾脏、鳃、前肾、脑、肠道、皮肤和肌肉等组织中均有表达,且以鳃组织中的相对表达量最高,是其他器官组织的2.0~3.0倍。吉富罗非鱼抗病家系和易感家系感染无乳链球菌后, CtsB基因在脾脏和肾脏中的相对表达量均显著上调 （P<0.05）,并于感染后50 h达峰值,且抗病家系的上调表达幅度大于易感家系。【结论】 CtsB基因在鱼类的进化过程中具有高度保守性,但在不同物种中的表达模式存在明显差异。CtsB基因是吉富罗非鱼的重要免疫因子,在抵御无乳链球菌入侵过程中发挥着重要的免疫作用,可作为罗非鱼抗病育种的SNP分子标记给予开发利用。     

尼罗罗非鱼CD209基因的克隆、表达及功能鉴定

为揭示尼罗罗非鱼模式识别受体CD209的分子结构、组织表达特性并初步了解其免疫功能, 利用聚合酶链式反应 (PCR) 获得尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus (体质量为100 g±5 g) CD209基因的开放阅读框片段 (open reading frame, ORF), 命名为OnCD209; 使用生物信息学软件对其氨基酸序列进行分析,采用RT-qPCR法对健康尼罗罗非鱼的各组织及无乳链球菌刺激后尼罗罗非鱼肝脏、脾脏、鳃和肠道的CD209基因表达量进行分析, 并构建了CD209-pEGFP-N1及CD209-pcDNA3. 1载体, 研究了CD209基因在293T细胞中的定位及在细胞中过表达时对NF-κB酶活性的影响.结果表明: OnCD209的ORF区片段长度为1 383 bp, 可编码460个氨基酸, 预测该蛋白具有一个C型凝集素结构域; 多重氨基酸序列比对及系统进化分析显示, CD209氨基酸序列在各物种间相对不保守, 尼罗罗非鱼与田纹狮子鱼Liparis tanakae的CD209氨基酸序列聚为一支, 亲缘关系最近; RT-qPCR结果显示, 所有组织 (脑、血液、皮肤、肌肉、头肾、肠道、鳃、肝脏、脾脏和胸腺) 中均能检测到OnCD209的mRNA表达, 且在血液中表达量最高; 尼罗罗非鱼在受到无乳链球菌感染后, OnCD209的表达在各组织中呈现相似的变化趋势, 大致呈先在6 h时上调, 后在12、 24 h时下调, 再在48 h后上调的表达模式; 亚细胞定位分析显示, OnCD209定位于细胞膜上; 双荧光素酶报告基因系统检测发现, OnCD209对NF-κB通路的活性显著性激活.研究表明, On-CD209可能参与尼罗罗非鱼对细菌的免疫应答过程及炎症反应过程.     

罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果研究

为研究无乳链球菌Streptococcus agalactiae表面免疫蛋白(surface immunogenic protein,SIP)微胶囊口服疫苗对罗非鱼Oreochromis niloticus的免疫效果,将制备的无乳链球菌SIP微胶囊疫苗口服免疫健康的罗非鱼,以注射免疫无乳链球菌灭活疫苗为阳性对照,口服包埋PBS的微胶囊颗粒为阴性对照,分别于免疫后0、7、14、28d取脾脏组织,通过实时荧光定量PCR方法检测脾脏组织中的白细胞分化抗原CD4、白介素IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子TNF-α、核转录因子NF-κB等5种免疫相关基因表达的变化,并于第5周进行人工感染攻毒试验,计算无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗对罗非鱼的相对免疫保护率。结果显示,免疫接种之后,SIP微胶囊疫苗口服免疫组(SIP疫苗组)和全菌灭活疫苗注射免疫组(灭活疫苗组)罗非鱼脾脏中的5种免疫相关基因表达均不同程度上调,且相对表达量显著高于阴性对照免疫组(阴性对照组)(P0.05)。在人工感染攻毒试验中,SIP疫苗组和灭活疫苗组的死亡率均显著低于阴性对照组(P0.05),灭活疫苗组比SIP疫苗组得到了更高的免疫保护率,但两组的死亡率差异不显著(P0.05)。说明罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果好,在罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治中有良好的应用前景。     

RNAi技术介导大豆蚜hsp70基因对其内源物质及激素表达的影响

通过siRNA hsp70干扰大豆蚜后,分析其体内hsp70基因、热休克蛋白70、内源物质和激素表达变化,寻找siRNA干扰效果最明显时间点。利用RNAi技术介导、Real-time qPCR技术、试剂盒,研究分析siRNA hsp70(0.33μg·μL~(-1))干扰2龄大豆蚜后1、2、3、12、24、48、72 h等处理,其体内hsp70基因、热休克蛋白70、内源物质和激素变化情况。结果表明,siRNA hsp70干扰2龄大豆蚜3 h时,hsp70基因表达量极显著低于清水对照组(P0.01),显著低于阴性对照组(P0.05),热休克蛋白70表达量、总糖含量、保幼激素含量极显著低于清水对照组和阴性对照组(P0.01),羧酸酯酶活性、谷胱甘肽S-转移酶活性、蜕皮激素含量极显著高于清水和阴性对照组(P0.01)。可知,siRNA hsp70(0.33μg·μL~(-1))干扰2龄大豆蚜在选测的7个时间处理中,3 h时效果最明显,此时大豆蚜体内各物质含量皆受影响,是开展大豆蚜药剂防治最佳时间点。     

持续热应激状态下肉鸡心脏和肾脏组织损伤与hsp_(60) mRNA转录

为研究环境胁迫条件下热休克蛋白60 mRNA(hsp60 mRNA)转录水平和应激性损伤的关系,将30日龄AA肉鸡的饲养环境温度从(22±1) ℃突然升高到(37± 1) ℃分别热应激1、2、3、5和10 h后剖杀,利用临床血液病理学、组织病理学和荧光定量PCR方法,观察热应激不同时间对肉鸡重要器官心脏和肾脏组织损伤及其hsp60 mRNA表达水平的影响.结果显示,持续热应激处理后的肉鸡血液肌酸激酶(CK)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)均显著升高,CK在2、3、5和10 h与对照组(无热应激)差异极显著(P<0.01),ALT在3 h与对照组差异显著(P<0.05),在5 h和10 h差异极显著(P<0.01);持续热应激处理2 h后的肉鸡心脏和肾脏组织均呈现出不同程度的以颗粒变性和水泡变性为主要特征的病理性损伤;心脏和肾脏组织中hsp60 mRNA转录水平在热应激2 h时显著高于对照组(P<0.05),而在5、10 h逐渐恢复正常.提示:hsp60 mRNA转录水平与其相应蛋白的表达和肉鸡组织的热应激损伤存在一定程度的关联性.     

三黄连合剂对罗非鱼人工感染海豚链球菌病的预防效果

[目的]探讨三黄连合剂对由海豚链球菌感染罗非鱼发病的预防效果,为罗非鱼链球菌病的免疫防治提供参考依据.[方法]分别以含30、60、120 mL/kg三黄连合剂的饵料投喂吉富罗非鱼,连续投喂7d,给药后第8d进行人工感染海豚链球菌,感染后第7d测定脾脏指数,同时于感染后0、12、24 h和7d采集血清样本,检测超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LSZ)、碱性磷酸酶(AKP)、血清补体C3、IgM抗体水平等免疫学指标.[结果]三黄连合剂连续给药7d对吉富罗非鱼血清免疫指标均有一定影响,可显著提高吉富罗非鱼血清SOD活性(P＜0.05,下同).人工感染海豚链球菌后第7d,3个三黄连合剂处理组的罗非鱼脾脏指数较感染不给药组明显升高;在免疫指标方面,高剂量组(120mL/kg)罗非鱼的血清SOD活性、AKP活性、LSZ活性、补体C3活性、IgM抗体水平均显著或极显著(P＜0.01)高于感染不给药组.[结论]三黄连合剂可减轻因海豚链球菌感染而造成的免疫抑制,保护机体免疫系统,提升免疫力,对罗非鱼感染海豚链球菌有良好的预防效果.     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

hsp70基因编码区一新SNP的发现及其多态性与热应激性状的相关性研究(英文)

为了探索hsp70基因多态性与热应激性状（直肠温度和红细胞钾含量）的相关性,利用PCR-SSCP方法检测290头中国荷斯坦奶牛hsp70基因的未知SNP,并利用PCR-RFLP方法对基因进行分型,采用SBYE荧光定量PCR方法检测不同组织中hsp70 mRNA表达水平。结果显示,在1524位点发现一个G/A突变,有两种基因型（AA/AB）,基因频率和基因型频率分别是0.957 0,0.043 0和0.913 7,0.086 3,卡方检验该群体处于哈迪-温伯格平衡。相关性分析结果表明,AA、AB基因型的直肠温度没有显著差异,但在红细胞钾含量中有极显著差异。肝脏中hsp70 mRNA表达水平显著高于其他组织。推测hsp70基因1524位点的G/A SNP与中国荷斯坦奶牛热应激有关。     

紫茎泽兰热激蛋白70基因的克隆与序列分析

热激蛋白70(HSP70)与植物的抗逆性密切相关。根据其他植物hsp70的保守性区域设计特异性引物,采用RT PCR方法从紫茎泽兰Ageratina adenophora中克隆到hsp70基因全长cDNA序列。序列分析结果表明,该cDNA包含1个 1 938 bp的开放阅读框(GenBank登录号:FJ598132),共编码645个氨基酸,相对分子质量为70.58 kDa,命名为hsp70.58。该蛋白包含真核生物HSP70高度保守的三个家族标签和末尾基序EEVD。运用实时定量PCR 分析,探测到hsp70.58在mRNA水平上皆能被高温和低温诱导表达,说明该基因属于诱导型hsp70基因。     

双重 PC R检测罗非鱼源无乳链球菌方法的建立

根据罗非鱼源无乳链球菌16S rRNA 基因和sip基因序列,设计、合成2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,建立快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。该方法扩增无乳链球菌可获得1305 bp和121 bp 2个特异性片段;对6株链球菌属的菌株进行特异性分析,仅无乳链球菌能扩增出16S rRNA 基因和sip基因2条特异性条带,而海豚链球菌无条带检出;经灵敏度试验,可检测到无乳链球菌菌株070717LL的最小量为1.05＆#215;10^2 CFU ;同时,双重PCR可以检测出无乳链球菌菌株070717LL人工感染的罗非鱼脾、脑、肾组织中细菌DNA ,特别是脾脏和肾脏组织的样品检测效果好。结果证明所建立的方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对罗非鱼源无乳链球菌病的流行病学调查。     

无乳链球菌感染方式对罗非鱼血常规和抗体消长规律的影响

【目的】明确表皮损伤或某种原因造成的炎症是否是罗非鱼无乳链球菌病暴发的重要诱因，为罗非鱼养殖业疫情预警及无乳链球菌疫苗研制提供参考依据。【方法】将180尾体质量约40 g的吉富罗非鱼随机分为健康组、皮肤创伤组和肠炎组，通过浸泡方式感染无乳链球菌（1.5×106 CFU/mL），分别设3个对应的空白对照组（不感染无乳链球菌）。无乳链球菌感染前及感染后24、48、72、96、120、144和168 h等8个时段，分别每组随机挑选15尾罗非鱼采血，将血液涂片后以吉姆萨染色，观察细胞形态并统计外周血白细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞数量，同时记录罗非鱼死亡数量。每周以ELISA测定1次罗非鱼血清IgM抗体水平，持续10周。【结果】与健康组罗非鱼相比，皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼死亡时间提前，存活率显著降低（P<0.05，下同）。3种感染方式的罗非鱼外周血白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量在感染初期均呈明显的上升趋势，至感染后168 h皮肤创伤组和肠炎组罗非鱼显著高于健康组罗非鱼（P<0.01，下同），说明无乳链球菌感皮肤创伤或患有肠炎的罗非鱼相对于健康鱼能引起更强烈的免疫反应；皮肤创伤组罗非鱼的外周血单核细胞数量在感染后72~168 h均极显著高于健康组罗非鱼，而肠炎组罗非鱼只在感染后24 h极显著高于健康组罗非鱼。相对于健康组和皮肤创伤组罗非鱼，肠炎组罗非鱼血清抗体水平上升时间更早，持续高水平时间更长；健康组和皮肤创伤组的罗非鱼血清特异性抗体出现时间相近，但皮肤创伤组罗非鱼抗体维持高水平的时间更长。【结论】罗非鱼在无乳链球菌感染前后并发机械性或免疫性病理损伤及炎症，会导致感染死亡率升高，即感染无乳链球菌后会加重因转池、运输、寄生虫感染等造成鱼体表皮受损，或饲料霉变等原因造成的肠炎，进而导致罗非鱼死亡率上升。血常规和抗体水平的消长规律能反映罗非鱼无乳链球菌的感染情况，其中，外周血白细胞数量变化可作为判断罗非鱼感染无乳链球菌后病理损伤和免疫应答的参考指标。     

乳酸杆菌对罗非鱼生长和抗病力的影响

【目的】探讨乳酸杆菌对罗非鱼生长和抗病力的影响,为乳酸杆菌在水产养殖上应用提供参考依据。【方法】将乳酸杆菌分别按0.1%、0.2%、0.3%的比例添加于饲料中投喂罗非鱼,在饲养20d后分别计算增重率、存活率及饲料系数,并以链球菌悬液进行攻毒试验,统计攻毒后7d内的累积死亡率及攻毒后第2d罗非鱼的肠道菌群。【结果】以添加乳酸杆菌的饲料投喂罗非鱼,其增重率显著高于未添加乳酸杆菌的对照组,饲料系数则显著降低,且随添加比例的增加,罗非鱼增重率呈上升趋势、饲料系数呈下降趋势。链球菌攻毒试验结果表明,投喂添加乳酸杆菌饲料的罗非鱼的抗病力高于对照组,且添加比例越高,抗病力越强。测定罗非鱼的肠道菌群发现乳酸杆菌可有效抑制罗非鱼肠道病菌的增殖。【结论】乳酸杆菌有利于促进罗非鱼的生长和提高抗病力,可在水产养殖中推广应用。     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.     

罗非鱼海豚链球菌PCR检测方法的建立

为建立准确快速的海豚链球菌鉴定方法,设计合成了海豚链球菌种特异性引物CM1/CM2,进行了其特异基因片段的PCR扩增、反应条件的优化及方法的特异性和敏感性试验;同时还进行了不同检测材料的比较及9份临床样品检测.结果表明,引物CM1/CM2只能从海豚链球菌中扩增到特异性基因片段,供试的其它9种水产常见病原菌PCR扩增均呈阴性;能够检测的最低细菌数在20～30个细菌;方法可直接从病鱼的脑、肝脏、肾脏及脾脏组织检测到该菌;另外,临床菌株检测结果与基于菌株16S rRNA基因序列系统进化分析结果一致.该方法弥补了传统细菌鉴定很难将该菌鉴定到种的缺点,并显著缩短了检测时间及降低了检测成本,具有较好的应用前景.     

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因（ifi44）在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸［Poly（I:C）］刺激过程中的表达模式，为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框（ORF），通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析，根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况，并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后的时序表达情况。【结果】 On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp，编码478个氨基酸残基，其编码蛋白分子量为52.7 kD，理论等电点（pI）为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域（1~157 aa）和1个GTP-bd结构域（197~322 aa），不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%；基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支，二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达，且主要在T细胞亚群表达；经无乳链球菌感染和Poly （I:C）刺激后，On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化，且存在明显的时间依赖性。【结论】 On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域，进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能； On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly（I:C）刺激后呈时间依赖性上调表达，表明ifi44基因作为重要的调节因子，参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。     

复方蜈蚣藻对罗非鱼生长和抗病力的影响

为探讨复方蜈蚣藻对罗非鱼生长和抗病力的影响作用,将复方蜈蚣藻分别按1％、2％、3％的比例添加至饲料中,以其投喂罗非鱼,并在饲养20d后以链球菌悬液进行攻毒试验。结果表明,以添加复方蜈蚣藻的饲料投喂罗非鱼,其增重率显著高于未添加复方蜈蚣藻的对照组,饲料系数则显著降低;且随添加比例的增加,罗非鱼增重率呈上升趋势,而饲料系数呈下降趋势。链球菌攻毒试验结果也表明,投喂添加复方蜈蚣藻饲料的罗非鱼的抗病力亦高于对照组,且添加比例越高,其抗病力越强。     

乳酸杆菌对罗非鱼生长和抗病力的影响

【目的】探讨乳酸杆菌对罗非鱼生长和抗病力的影响,为乳酸杆菌在水产养殖上应用提供参考依据。【方法】将乳酸杆菌分别按0.1%、0.2%、0.3%的比例添加于饲料中投喂罗非鱼,在饲养20 d后分别计算增重率、存活率及饲料系数,并以链球菌悬液进行攻毒试验,统计攻毒后7 d内的累积死亡率及攻毒后第2 d罗非鱼的肠道菌群。【结果】以添加乳酸杆菌的饲料投喂罗非鱼,其增重率显著高于未添加乳酸杆菌的对照组,饲料系数则显著降低,且随添加比例的增加,罗非鱼增重率呈上升趋势、饲料系数呈下降趋势。链球菌攻毒试验结果表明,投喂添加乳酸杆菌饲料的罗非鱼的抗病力高于对照组,且添加比例越高,抗病力越强。测定罗非鱼的肠道菌群发现乳酸杆菌可有效抑制罗非鱼肠道病菌的增殖。【结论】乳酸杆菌有利于促进罗非鱼的生长和提高抗病力,可在水产养殖中推广应用。