一株中等毒力牛种布鲁氏菌的鉴定和毒力测定

【目的】对初步鉴定的牛种布鲁氏菌分离株（B. abortus 343）进行全面的生物学特性检定,为深入研究布鲁氏菌病提供参考菌株。【方法】将B. abortus 343划线培养及梯度稀释,使其形成单个菌落,观察菌落形态。挑取单个菌落进行革兰氏染色和柯氏染色,观察其染色特点;分别接种1.5×106 CFU到含硫瑾（1﹕25 000）或含碱性复红（1﹕25 000）的TSA平板上,观察其生长状态;将接种有B. abortus 343的TSA平板分别置于普通培养箱和CO2培养箱37℃培养72 h,观察其对CO2的依赖性;通过醋酸铅试纸条测定B. abortus 343代谢过程中是否释放H2S。通过平板凝集试验测定布鲁氏菌单相特异性血清（ 牛种布鲁氏菌单因子血清A、羊种布鲁氏菌单因子血清M 和 布鲁氏菌粗糙型血清R ）与B. abortus 343抗原的反应性;利用布鲁氏菌AMOS-PCR种属分型等方法对B. abortus 343进行了PCR种属特性鉴定;将B. abortus 343免疫小鼠,分别测定其抗血清与光滑型和粗糙型抗原的反应性;通过小鼠和豚鼠感染试验,全面评价该分离株的毒力;分别以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,测定B. abortus 343在小鼠体内存活时间;以1×109 CFU感染Hartley豚鼠,2周后测定试验豚鼠每克脾脏含菌量;分别以10 000、1 000、100、25 CFU/只4种不同剂量感染豚鼠,初步测定分离株对豚鼠的最小感染量（MID）,在此基础上,进一步以40、60和90 CFU/只测定MID。【结果】分离株B. abortus 343 为光滑型牛种布鲁氏菌,菌落逆光观察微带蓝绿色乳光;革兰氏染色为阴性,柯氏染色为红色,H2S试验阳性。该菌能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长,不依赖于CO2。B. abortus 343抗原能与A因子血清呈明显凝集反应,免疫小鼠后能产生特异性抗体。以1×105 CFU感染6周龄Balb/c小鼠,可在小鼠体内存活29周;以1×109 CFU感染350-400 g雌性豚鼠,14 d后豚鼠每克脾脏含菌量2.4×105-1.2×106;以1×105 CFU感染豚鼠1个月后,所有试验豚鼠均能产生特异性光滑型抗体,试管凝集效价为320-1 280;B. abortus 343对豚鼠的最小感染量约为40 CFU。【结论】鉴定了一株中等毒力牛种布鲁氏菌（B. abortus 343）,为深入研究布鲁氏菌病提供了参考菌株,丰富了布鲁氏菌菌种资源。     

猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶缺失株的构建

 【目的】猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）为一种重要的人兽共患病病原,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）为SS2新近鉴定的一个蛋白,本文旨在体外构建基因缺失株明确IMPDH与SS2致病力的相关性。【方法】选用自杀性质粒,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组,获得impdh基因缺失株。通过接种不同敏感动物,明确缺失株致病力的变化。【结果】经过PCR鉴定,impdh基因被氯霉素（cat）选择标记基因表达盒所代替,Western blot鉴定结果显示,IMPDH单抗没有检测到相应的IMPDH蛋白。SS2-H（△IMPDH）对6种糖的发酵能力降低、生长速度减慢、产酸减少一个pH滴度和对本动物和试验动物的致病力减低。SS2-H（△IMPDH））对于Balb/c小鼠LD50是8.3×108 CFU,而SS2-H的LD50是3.36×108 CFU;对新西兰家兔只引发体温升高(高于正常体温至少1℃),不致死;对于断奶仔猪,只表现临床症状,但不引起死亡。【结论】本研究成功获得IMPDH缺失株,即SS2-H（△IMPDH）,并且明确IMPDH的缺失导致了SS2对仔猪、家兔和Balb/c小鼠的致病力降低。     

流产布鲁氏菌ATP/GTP结合蛋白基因缺失株保护力及安全性研究

为筛选具有诊断标记的布鲁氏菌病疫苗菌株,本研究利用同源重组和负筛选技术,构建了流产布鲁氏菌株2 308的ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14,并通过菌落染色和凝集特性,培养传代,小鼠接种试验及怀孕羊攻毒试验对其生物学特性、安全性和免疫效果进行了研究.结果表明:1)缺失菌株BDA14为粗糙型菌株,体外培养传代表型不发生改变;2)缺失菌株BDA14在小鼠体内的毒力与亲本菌株2308相比显著降低,且不产生针对OPS(O-antigen)的抗体;3)缺失菌株BDA14可提供与疫苗株RB51相当的攻毒保护力;4)缺失菌株BDA14对怀孕靶动物的安全性显著提高,接种怀孕羊不引起流产.说明ATP/GTP结合蛋白基因缺失株BDA14作为安全、有效且能鉴别诊断的疫苗菌株有明显优势.     

猪圆环病毒2型不同分离株体内增殖特性的研究（英文）

【目的】探讨PCV2感染后血清和组织中病毒含量的动态变化以及不同PCV2毒株间的差异。【方法】建立了快速、敏感和特异的用于检测猪圆环病毒2型的SYBR Green I荧光定量PCR方法。以200μL 1×10~6TCID_(50)/mL的猪圆环病毒2型不同分离株攻毒Balb/c小鼠,于不同时间采集感染后血清和组织,利用SYBR Green I荧光定量PCR进行病毒含量的测定。【结果】结果表明,该Real-time PCR能够检测出PCV2,具有较高的特异性。利用该方法对不同毒株攻毒后的Balb/c小鼠进行检测,结果显示攻毒后14天均可以在小鼠的血清中检测到PCV2,2007HA株(PCV2c)最高,达1.21×10~8拷贝/mL;21天时均降低;攻毒后28天又有上升趋势,2010NJ(PCV2b)最高。肺脏和脾脏的检测结果表明,2010NJ和2009ZJ两株PCV2b分离株的脏器病毒含量最高。【结论】PCV2不同分离株在Balb/c小鼠中增殖效率是不同的,且2009ZJ株在脏器中的增殖率明显高于血清,其他毒株则不明显,这也为分析PCV2不同毒株的体内增殖特性和致病性奠定基础。     

牛源犬新孢子虫NcSAG1基因重组腺病毒株的构建及动物免疫试验

【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1™感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和Western blotting技术检测Ad5-NcSAG1及其表达蛋白产物。测定Ad5-NcSAG1重组腺病毒滴度后,接种Balb/c小鼠,测定小鼠血清中IgG特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4水平,以此评价重组腺病毒株的免疫应答效果。【结果】扩增的牛源犬新孢子虫NcSAG1基因大小为982bp,与GenBank中发表的NcSAG1（AF132217）核苷酸序列的同源性为99.2%;经PCR和Western blotting检测,重组腺病毒Ad5-NcSAG1在QBI-HEK 293细胞中包装成功,表达蛋白的分子量为33kD,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSAG1滴度为1010TCID50/mL,Ad5-NcSAG1接种Balb/c小鼠后,能够诱导产生高水平的IgG特异性抗体和IFN-γ、IL-4细胞因子。说明Ad5-NcSAG1重组腺病毒对Balb/c小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答。【结论】成功构建了牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,该毒株能够诱导Balb/c小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,为犬新孢子虫新型疫苗的临床试验奠定了基础。     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌诱导小鼠产生特异性抗体

 【目的】研究以干酪乳杆菌作为传递抗原活载体表达猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2蛋白的免疫特性。【方法】将构建的重组猪细小病毒（PPV）VP2基因的细胞表面表达型载体pPG-VP2电转化干酪乳杆菌L.casei 393,获得阳性重组菌pPG-VP2/L.casei 393。重组菌以2%乳糖为诱导物,在MRS培养基中进行诱导,经SDS-PAGE、Western blot及间接免疫荧光分析,目的蛋白获得表达。将重组菌及空质粒菌株分别口服接种Balb/c小鼠,收集粪便及肠黏液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性sIgA,采集血液样品测定小鼠产生抗VP2的特异性IgG,并对获得的抗体进行PPV中和活性的测定。【结果】重组干酪乳杆菌pPG-VP2/L.casei393免疫小鼠能够产生明显的抗PPV的sIgA和IgG抗体水平,其对PPV的中和效价分别为1﹕24和1﹕128。【结论】为PPV重组乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要的物质基础。     

PEDV CH-HeB14株S1蛋白表达及其多克隆抗体的制备

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH-HeB14毒株S1蛋白的多克隆抗体,为PEDV新流行毒株诊断试剂盒和疫苗研制提供基础材料。【方法】利用RT-PCR扩增PEDV CH-HeB14毒株S1基因,对序列特征进行生物信息学分析,用PCR将S1基因截成不同片段(S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2),分别克隆至原核表达载体pET28a,转化BL21(DE3)构建重组表达菌株;用IPTG诱导重组蛋白表达,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。将表达蛋白与佐剂乳化制备免疫原免疫兔多克隆抗体,Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。【结果】PEDVS1、S1A、S1B、S1C、S1C-1和S1C-2片段长度依次为2 079,600,600,878,549和447bp。系统进化树表明,CH-HeB14株与2010年以来的22个新流行毒株亲缘关系较近,而与经典疫苗株CV777、attenuated DR13亲缘关系较远。成功截短表达了S1蛋白不同区段S1A、S1B和S1C-1重组蛋白(rS1A、rS1B和rS1C-1),且蛋白均以包涵体形式表达。制备了抗rS1A、rS1B和rS1C-1蛋白的多克隆抗体,其与这3种蛋白反应良好,且抗rS1A重组蛋白的多克隆抗体Western blotting效价为1∶32 000;IPMA结果显示,该抗体能与PEDV CHHeB14毒株和经典疫苗毒株attenuated DR13均发生特异性反应。【结论】成功克隆、表达了变异毒株PEDV CHHeB14的S1基因,所制备的S1蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

bp26对布鲁氏菌疫苗株M5免疫应答和免疫保护性的影响

对目前常用的羊布鲁氏菌减毒活疫苗株M5进行了遗传改造,利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了M5的bp26基因,得到了新的缺失突变株M5△bp26,并对bp26对疫苗株M5的免疫应答和免疫保护效果的影响进行了初步评价.分别用M5△bp26和M5免疫小鼠,与M5比较,M5△bp26的体液和细胞免疫应答能力均明显减弱,免疫保护效果也显著下降,说明bp26基因的缺失明显影响了M5疫苗株的免疫应答能力及其保护性,即bp26对疫苗株M5的免疫应答和保护效果有一定的影响.     

表达猪轮状病毒VP4基因重组乳酸球菌表达载体构建及免疫原性分析

 【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。