绒山羊胚胎期和兴盛期皮肤毛囊差异表达基因研究

应用抑制性消减杂交技术成功构建了内蒙古绒山羊胚胎期和兴盛期皮肤毛囊的消减cDNA文库.从两个文库中分别随机挑取50个克隆测序分析,测序结果经Genbank同源性比对.表明在胚胎期消减cDNA文库中得到15个特异表达基因片段,包含1个未知新序列;在兴盛期消减cDNA文库中得到19个特异表达基因片段.包含2个未知新序列.     

白粉菌诱导的中国野生毛葡萄抑制消减文库构建及EST序列分析

【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。     

甘蔗水分胁迫响应相关醛脱氢酶基因的克隆及其表达特征分析

 【目的】筛选并克隆与水分胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗旱机制,为甘蔗抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】应用消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选水分胁迫诱导的基因的EST序列,根据筛选到感兴趣的上调表达基因的EST序列,用RACE技术获得SSADH的全长cDNA序列,并通过实时荧光RT-PCR技术对该基因的表达特征进行分析。【结果】通过消减文库技术结合cDNA芯片技术筛选的EST中含有4个推测为基因SSADH 的EST,其在水分胁迫处理的斑茅中均明显上调表达。通过RACE扩增获得甘蔗SSADH全长cDNA序列为1 914 bp,其中5′端非编码区25 bp,开放阅读框为1 581 bp,3′端非编码区306 bp,在1 749处有终止加A信号AATAA。克隆的甘蔗全长cDNA序列进行NCBI比对分析显示,所克隆的甘蔗SSADH全长cDNA与拟南芥（NM_106592.3）的ALDH5F1同源性为73%,表明克隆的cDNA序列可以归为甘蔗的醛脱氢酶家族基因ALDH5F1。通过荧光实时PCR分析SSADH表达表明,该基因参与干旱胁迫下的全程响应,并证明水分胁迫下该基因表达与Ca2+的存在调控关系。【结论】克隆了甘蔗基因SSADH,该基因为一个水分胁迫响应基因;SSADH的植物在体表达与Ca2+存在调控关系。克隆的基因SSADH可用于植物抗逆性调控研究。     

草鱼肠道组织抑制性消减表达序列标签的初步分析

以致病性嗜水气单胞菌(Aeramonas hydrophila)人工感染的草鱼肠道组织为材料,采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织消减cDNA文库,对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得147个草鱼肠道表达序列标签(EST).序列同源性搜索结果表明,97个EST代表了46个已知基因,其余50个EST为未知序列.与细胞防御相关的EST有43个,分属13个基因.     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建甘蔗根系全长cDNA文库，并进行测序，为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础。【方法】在干旱胁迫条件下，以新台糖22号甘蔗根系为材料，采用SMART技术构建cDNA文库，并进行EST序列分析。【结果】文库构建质量鉴定结果显示，文库库容量为1.0×106 PFU/mL，重组率约95%，文库插入片段长度在 500～2000 bp，平均长度约1102.1 bp。挑选526个阳性克隆进行单向测序后，共获得 523个ESTs序列，去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后，进行聚类分析并组装，共得到468个Uni-ESTs，其中congtig 29个，singlets 439个，分别占总数的6.5%和93.5％。通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对，发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列，占94.87%；获得24个未知蛋白功能基因，占5.13%。【结论】构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库，获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs，并获得一批新的未知蛋白功能基因。     

叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况，从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料，利用抑制差减杂交技术，构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库，随机挑取文库中的阳性克隆测序，并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库，共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序，获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后，共获得107条非重复序列（Unigene），与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对，其中70条非重复序列与已知基因同源性很高，占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析，推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建

 【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。     

巨型艾美球虫株间差异表达基因消减文库的构建和分析

为分离鉴定巨型艾美球虫上海株与南通株间免疫原性的差异表达基因,分别以巨型艾美球虫上海株孢子囊cDNA为驱动组,以南通株孢子囊cDNA为试验组,或相反,利用抑制消减杂交(SSH)方法,通过2轮杂交和2次PCR分别构建了2个抑制性消减文库.随机从2个消减文库中分别挑取96个克隆产物,经PCR鉴定上海株和南通株孢子囊消减文库的重组率分别为91%和94%,差异基因片段大小为250～1 000 bp.从每个文库中随机挑取30个阳性克隆测序,并进行同源性比较分析,结果表明:从上海株cDNA消减文库中获得了19个单一有效序列,其中15个为未知序列;从南通株cDNA消减文库中获得了16个单一有效序列,其中13个为未知序列.这些结果将为分离巨型艾美球虫新功能基因和进一步探索球虫抗原变异相关的分子机理奠定基础.     

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序，发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因，为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料，利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列，采用生物信息分析手段，对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库，该文库滴度为1.2×106 pfu•mL-1，平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆，获得5 233条高质量表达序列标签（EST），序列拼接出3 922个单一基因；同源比对分析表明，89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性，这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能；并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库；大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。     

蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

 【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因，研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库，利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析，获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较，发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测，结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）；GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性，这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。     

中国美利奴超细型与哈萨克羊毛囊兴盛期皮肤组织消减cDNA文库的构建

【目的】筛选影响绵羊羊毛性状的重要候选基因，为研究羊毛性状形成的分子机制奠定基础。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建中国美利奴超细型和哈萨克羊兴盛期皮肤组织间正、反向消减cDNA文库，并对差异基因进行测序和生物信息学分析；应用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。【结果】①从所构建绵羊皮肤组织的正、反向消减cDNA文库中分别获得153和143个ESTs，其中分别包括5和4个未知功能的ESTs，推测可能是新基因；对部分已知功能ESTs进行了GO聚类分析、通路分析和蛋白互作分析，结果显示粗、细毛羊之间存在一定差异；②文库中的3个差异基因KRTAP8-2、Trichohyalin和KRTAP3-2均能在皮肤中特异性地高表达，其中KRTAP8-2和Trichohyalin基因在中国美利奴超细型羊皮肤组织中的表达丰度分别是哈萨克羊的3.45和2.07倍，而KRTAP3-2基因在哈萨克羊皮肤组织表达丰度是中国美利奴超细型羊的1.87倍。【结论】成功构建了中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织间抑制性消减cDNA文库，初步筛选出一批可能影响羊毛性状的差异表达ESTs。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料，以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理，以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照，分别提取RNA，采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库，在文库中，选择3个EST序列，用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp，经筛选文库，得到正交库有效的ESTs 85条，反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对，其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性，31条为未知功能序列，已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析，证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能，涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面，其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条，下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术，获得抗霜霉病基因全长序列，并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能，为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫(Theileria annulata)可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞(即非转化宿主细胞)为试验材料,提取总RNA和m RNA,反转录合成c DNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交(SSH),构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签(ESTs)364条,大小主要分布在350—1 200 bp之间;将这些ESTs序列在Gen Bank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条(其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列)和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。     

羊绒生长期、休止期陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达

【目的】研究角蛋白相关蛋白9.2基因(KAP9.2)和Hoxc13基因在羊绒生长不同阶段皮肤组织中的表达量对产绒量的影响，为羊绒生长的调控机理研究奠定基础。【方法】以陕北白绒山羊为研究对象，以奶山羊作为对照，利用qRT-PCR方法，检测羊绒生长期和休止期高产、低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因的表达量。【结果】 对于KAP9.2基因，在羊绒生长期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著低于低产绒量陕北白绒山羊（P＜0.01），而在羊绒休止期高产绒量陕北白绒山羊的相对表达量却显著高于低产绒量陕北白绒山羊和奶山羊（P＜0.05）；对于Hoxc13基因，在羊绒休止期高产和低产绒量陕北白绒山羊的相对表达量极显著高于奶山羊（P＜0.01）。高产和低产绒量陕北白绒山羊皮肤组织中KAP9.2和Hoxc13基因在生长期、休止期平均相对表达量的变化趋势相似，均表现为生长期极显著低于休止期（P＜0.01）。【结论】KAP9.2对绒毛生长有抑制作用；Hoxc13对KAP9.2基因的表达可能具有调控作用。     

短枝型苹果SSH文库构建及相关基因表达分析

【目的】寻找苹果短枝型枝条形成相关基因,为进一步探索苹果短枝型芽变形成机理及选育新的短枝型苹果品种奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术构建正反向苹果短枝型芽变枝条和正常型枝条差异表达cDNA文库,利用荧光定量RT-PCR验证文库中克隆的插入片段。【结果】从两个文库中共获得291个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在300—600 bp之间。利用GenBank的BLAST比对分析,其中126个表达序列标签（EST）找到了与之匹配的同源序列。获得的cDNA片段功能涉及代谢、转录、胁迫响应、转运、光合和信号转导;有165个EST片段未找到同源序列。对文库中EST序列进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果显示这些EST序列在短枝型芽变枝条与正常型枝条之间差异性表达。【结论】通过构建短枝型苹果正反向文库,得到一些与短枝型苹果枝条节间长度相关联的基因,这些基因可能对短枝型苹果枝条的伸长具有一定作用。     

茄子温敏单性结实抑制差减文库的构建与分析

 【目的】构建茄子单性结实差减文库，分离获得茄子单性结实相关基因，研究茄子单性结实形成的分子机制。【方法】以茄子单性结实品系D-10低温条件下无籽的子房和果实，以及适温条件下有籽的子房和果实为材料，采用抑制差减杂交（SSH）技术构建正向和反向差减文库。对阳性克隆测序、BLAST比对分析、GO（gene ontology）功能注释及分类和荧光定量PCR分析。【结果】正反向文库共获得了2 347个阳性克隆；测序、序列拼接后，共获得1 248个高质量的unigenes；将其与非冗余数据库BLAST比对后，有1 109个unigenes找到同源序列，139个unigenes无同源序列为新基因。1 248个unigenes中527个在GO数据库中有功能注释，其中细胞组分、分子功能和生物过程的unigenes分别为206、445和361条，分析表明，茄子单性结实果实的差异主要发生在细胞内部，单性结实性状的表达可能受到一些因子和激酶的调控。【结论】成功构建了茄子单性结实不同时期果实的抑制差减文库，获得3个可能与茄子单性结实相关的unigenes，包括MADS-box基因、雌蕊伸展相关蛋白和果实膨大相关基因。     

河西绒山羊次级毛囊超微结构的周期性变化

【目的】研究成年绒山羊次级毛囊组织超微结构的周期性变化过程，为研究绒山羊绒毛生长的分子调控机理奠定形态学基础。【方法】活体采集的皮肤样品，经3%的戊二醛前固定和锇酸的后固定，通过上行酒精梯度脱水后进行包埋。制作河西绒山羊一年周期内每个月的皮肤超薄切片，经铀和铅双染色后在透射电镜下进行超微结构的观察、拍照和分析。【结果】河西绒山羊次级毛囊组织的超微结构随着毛生长周期呈周期性变化，可分为5个不同的时期，即1—2月为休止期、3—4月为生长前期、5—8月为生长期、9—10月为退行前期、11—12月为退行期。【结论】阐述了河西绒山羊次级毛囊在一个完整的生长循环过程中所处的5个不同的时期，为绒山羊绒毛相关领域的研究奠定超微结构方面的基础。     

C57BL/6和A/J两品系小鼠脾脏消减cDNA文库的构建及差异基因分析

【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标，构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因，以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标，抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization，SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明，A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05），而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序，去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较，26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性，2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源，为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。