青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测

根据马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白基因的保守序列设计了一对寡聚核苷酸引物,从田间自然感染PLRV的马铃薯病株中提取病毒总RNA,用反转录-聚合酶链式反应扩增出符合设计大小240bp的特异性产物,而对照没有任何扩增产物。建立了快速、准确检验PLRV的分子检测方法,为青海省马铃薯生产中卷叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕北8个县(区)种植2~3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,对CP基因进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列的一致性。结果表明,从陕北8个县(区)马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致、长度为336 bp的目的片段,说明马铃薯均感染了卷叶病毒。陕北8个县(区)马铃薯卷叶病毒CP基因之间的序列一致性达99.6%以上,与国内外其他地区10个样品CP基因的序列一致性为96.2%~99.8%,表明马铃薯卷叶病毒的CP基因序列比较保守。     

用酶联免疫吸附试验检测马铃薯卷叶病毒

本文介绍用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法快速检测马铃薯叶片及块茎内的马铃薯卷叶病毒(PLRV),检测叶片的最高稀释倍数为1/128,检测块茎的最高稀释倍数为1/64。马铃薯病株的顶部叶片和底部叶片的病毒含量不同,而又没有一定的规律性。马铃薯感染PLRV后可表现为底叶卷叶、部分全株卷叶或顶叶卷叶,有的品种无症;还有一部分植株虽然表现出各种卷叶症状,但并不是由PLRV所致。我院马铃薯育种圃内常用的杂交亲本的带毒率为31.21％;在黑龙江省的几个主栽品种上均可检测到PLRV。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

马铃薯卷叶病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

本研究克隆马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)衣壳蛋白(Coat Protein,CP)基因,改造其密码子,使其偏好原核表达,构建pCzn1-PLRV CP重组表达载体,通过大肠杆菌表达纯化,经Western Blot方法鉴定为PLRV CP蛋白,纯化后的蛋白免疫日本大耳兔,成功制备PLRV CP蛋白多克隆抗体,识别重组蛋白效价为128000倍,识别PLRV叶片的效价为32000倍,经Western Blot方法分析,其特异性良好.本研究为PLRV检测方法的建立及脱毒种薯的检测提供了必需的生物材料.     

冬种马铃薯卷叶病田间调查及RT-PCR检测技术研究

对惠州市冬种马铃薯卷叶病发病情况进行调查研究,建立了马铃薯卷叶病毒(PLRV)RT-PCR检测技术。结果表明,马铃薯卷叶病发病率为3.0%～29.7%。比较LiCl、异硫氰酸胍和试剂盒3种方法提取马铃薯卷叶病毒总RNA,以异硫氰酸胍和试剂盒提取效果较好,LiCl次之;根据卷叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,从感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,合成cDNA并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约336bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康叶片RNA扩增未得到任何产物。应用RT-PCR技术对马铃薯试管苗和种薯进行了卷叶病毒检测。     

马铃薯卷叶病毒福建分离物的基因克隆与序列分析

依据马铃薯卷叶病毒外壳蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链式反应扩增得到了PLRV福建分离物外壳蛋白基因,克隆并测定了其核苷酸序列,进行了同源性分析.依据PLRV外壳蛋白氨基酸序列建立了PLRV不同分离物的系统进化树.     

马铃薯卷叶病毒分离株外壳蛋白基因和17k蛋白基因的克隆及序列分析

从典型的马铃薯卷叶病毒病株中直接提出植物总RNA，根据PLRV外壳蛋白基因序列，设计合成了一对寡核苷酸引物，经RT－PCR法扩增出全长的cDNA片段，将其克隆到质粒pGEM-3Zf( )上，并进行了序列分析。结果表明，克隆的cDNA片段由627个核苷酸组成，编码208个氨基酸组成的理论分子量为23k的蛋白，与PLRV外壳蛋白的大小一致；此外克隆片段还含有一个不同于外壳蛋白基因的阅读框架，该框架由465个核苷酸组成，编码155个氨基酸组成的理论分子量为17k的蛋白，与PLRV的17k蛋白大小一致，与国外报道的几个株系相比，PLRV分离和的外壳蛋白基因及17k蛋白基因的核苷酸同源率分别高达97.5%-99.7%和96.5%-99.6%，由此推测的氨基酸同源率高达97.6%－99.5%和96.1%-99.4%，说明所克隆的PLRV外壳蛋白基因和17k蛋白基因具有高度的保守性，本研究克隆了PLRV分离物外壳蛋白和17k蛋白基因的序列，为进一步进行抗PLRV基因工程研究奠定基础。     

表达PLRV CP基因的转基因马铃薯抗病性田间鉴定

以表达马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）基因的转基因马铃薯为供试材料，在接种病毒后续发感染条件下观察鉴定转基因株系的田间发病率，发病时间和发病指数．结果表明转基因马铃薯株系延迟发病时间、降低发病百分率和发病指数．     

陕北地区马铃薯X病毒CP基因的RT-PCR检测及其序列分析

【目的】分析陕北8个县(区)马铃薯X病毒外壳蛋白(CP)基因序列的一致性和变异性,明确病毒变异程度,为脱毒马铃薯的推广提供参考。【方法】以陕北8个县（区）种植2～3代疑似携带病毒的马铃薯叶片为材料,首先用Trizol法提取8个采样点马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯X病毒CP基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;然后对CP基因进行克隆并测序,使用DNAstar软件分析陕北马铃薯X病毒CP基因序列的一致性,并与国内外其他地区12个马铃薯X病毒进行比较,采用邻接法构建系统进化树。【结果】从陕北8个县（区）马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致的长度为620 bp目的片段,可知这些马铃薯均感染了X病毒。不同CP基因序列之间存在微小变异,8个县(区)样品间CP基因的序列一致性在95.2%～99.4%,与国内外其他地区12个样品CP基因的序列一致性在92.9%～98.5%。系统进化树显示,将X病毒可分为4个类群,而陕北8县(区) 马铃薯X病毒归属于其中的2个类群。【结论】马铃薯X病毒在陕北地区普遍存在,RT-PCR方法可快速、准确地检测到马铃薯X病毒,X病毒CP基因存在一定程度的变异。     

应用 RT-PCR 法快速检测马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列，设计合成了一对寡核苷酸引物，从感染ＰＬＲＶ的马铃薯病叶组织中提取出病毒的ＲＮＡ，进行ｃＤＮＡ合成及ＰＣＲ扩增，得到一条长度约６２０ｂｐ的特异ＰＣＲ扩增产物，与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的ＰＬＲＶ检测的新方法，其灵敏度要比ＰＬＲＶ的血清学检测方法高１０＾４倍，在基因水平上为ＰＬＲＶ的检测提供了更新手段，并在农业部植物检疫实验所马铃薯病毒检     

马铃薯抗卷叶病毒基因工程研究现状

综述了马铃薯抗卷叶病毒基因工程的研究进展。在抗马铃薯卷叶病毒基因工程研究中,主要采用RNA干涉、转抗马铃薯卷叶病毒基因、核酶剪切基因组、基因定点突变等方法获得抗马铃薯卷叶病毒植株,已经取得突破性进展。通过对抗病基因工程策略及取得的成效进行概括总结,旨在为抗马铃薯卷叶病毒育种工作提供借鉴。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

PLRV 56KD蛋白基因植物转化载体的构建

为培育转基因抗马铃薯卷叶病毒的新材料 ,采用二次连接法将存在于克隆载体 p L R5 6中的马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码区构建到双元载体系统的中间表达载体质粒p ROK 中 ,采用三亲融合法和直接导入法转化根癌农杆菌 LBA4 40 4 ,PCR法检测。实验表明 ,二次连接法效果优于一次连接法 ,两种连接法对比 ,二次连接法更适用于大分子质粒的重组。直接导入法比三亲融合法更简便 ,二者转化效率没有显著差异。实验构建完成马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码植物转化载体 ,建立了高效、简便的植物转化载体的构建方法     

葡萄卷叶伴随病毒1号河北和辽宁分离物CP基因序列分析

为获得葡萄卷叶伴随病毒1号(Grapevine leafroll-associated virus 1,GLRaV-1)中国分离物的分子信息,提高其检测可靠性,本研究从河北怀来和辽宁兴城地区带有明显卷叶症状的葡萄样品中提取的叶柄韧皮部总RNA,采用RT-PCR克隆了GLRaV-1的河北(GLRaV-1-HB)和辽宁分离物(GLRaV-1-LN)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因,并进行了序列分析。结果表明:GLRaV-1-HB和GLRaV-1-LN的CP基因核苷酸同源性为90.7%,由此推导的氨基酸同源性为93.8%;与已报道的国外3个GLRaV-1分离物的CP基因全序列相比,其核苷酸与氨基酸序列同源性分别为90.0%～96.0%和92.9%～97.5%。以CP基因序列构建的进化树表明,现有的5个分离物可分为3组,其中本研究得到的GLRaV-1-HB和GLRaV-1-LN,分别与巴西分离物(GLRaV-1-PS,GenBank登录号为GQ332536.1)和伊朗分离物(GLRaV-1-IR-S7,FJ952151.2)为一组;澳大利亚分离物(GLRaV-1-AUS,AF195822.1)单独为一组。     

甘肃葡萄扇叶病毒和卷叶病毒的检测

采用 DAS-ELISA 检测方法对甘肃地区的葡萄主要品种进行扇叶病毒和卷叶病毒的调查和测定。结果表明,这两种病毒病在甘肃地区的主要葡萄产区均有发生。兰州地区和一些老的葡萄产区葡萄带病毒病较严重。通过对比植株下部枝条的幼叶、幼茎、老叶和老茎病原的检测结果,说明植株下部幼嫩组织是卷叶病毒最适的检测部位。     

褪绿卷叶病对杏叶片光合特性和解剖结构的影响

在田间调查的基础上,分析了杏褪绿卷叶病株的光合特性以及叶片叶绿素含量、单叶面积、含水量等生理指标与正常植株的差异,并对其叶片结构进行了解剖观察。研究结果表明,光合特性的各指标在正常株与感病株之间无显著性差异,但感病株的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度均低于正常株,而蒸腾速率则高于正常株。光响应曲线表明感病株光饱和点1 860μmol/（m2.s）高出正常株1 120μmol/（m2.s）50%以上。感病植株的叶绿素含量、叶面积、总含水量等各项指标均低于正常植株。解剖学研究表明,感病植株的叶片厚度和栅栏组织的厚度极显著性低于正常植株。上述结果综合反映出感病株叶片光合能力的衰退和减弱。