猪Sar1b基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sar1b基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sar1b基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3.1( ),获得pcDNA3.1( )-Sar1b重组载体.通过菌液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3.1( )-Sar1b构建成功.     

含O型FMDVP1-2A、3C基因和EGFP基因表达盒的构建

采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达

为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。     

表达小反刍兽疫病毒H基因的山羊痘病毒通用转移载体的构建及鉴定

［目的］研制小反刍兽疫羊痘活载体疫苗。［方法］利用PCR技术扩增小反刍兽疫病毒H基因,克隆到pGEM-T easy载体,Nhe Ⅰ和Hin-d Ⅲ双酶切重组质粒,将目的片段插入到真核表达载体pEGFP-N1-P7.5中,得到重组载体pEGFP-N1-P7.5-H,重组载体Hin-d Ⅲ、NheⅠ双酶切片段EGFP-P7.5 H平末端连接到KpnⅠ 酶切后的载体pUC119-TK中,得到通用转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-H。［结果］经酶切鉴定及PCR扩增检测,表明构建载体正确。pUC119-TK-EGFP-P7.5-H转染羊痘病毒感染的BHK21细胞,48 h后报告基因表达。［结论］该研究为研制小反刍兽疫基因工程活载体疫苗奠定基础。     

含O型FMDVP1-2A、3CC基因和EGFP基因表达盒的构建

采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMDI8-T载体,分别得到重组载体pUCll9-P1-2A和pMDI8-T-3C;将重组载体pUCll9-P1-2A用HindⅢ、BamH I酶切,重组载体pMDI8-T-3C用BamH I、Nhe I酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamH I酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMDI8-T-P1-2A-3C.,将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.     

猪Sarlb基因真核表达载体构建及鉴定

根据已发表的猪Sarlb基因序列设计合成1对带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,用RT-PCR方法从猪肝脏组织总RNA中扩增出Sarlb基因cDNA序列,纯化后,经BamHⅠ／XhoⅠ双酶切,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,获得pcDNA3,1（＋）一Sarlb重组载体。通过茵液PCR、双酶切及DNA直接测序分析,证实重组表达载体pcDNA3,1（＋）-Sarlb构建成功。     

含O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的羊痘病毒弱毒株转移载体的构建

利用已构建的口蹄疫病毒O/China99毒株的pMD18-T-P1-2A-3C载体和p-EGFP-N1-P7.5载体,分别通过HindⅢ、NheⅠ酶切,将基因P1-2A-3C连接到线性载体p-EGFP-N1-P7.5,构建了载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C。将EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。通过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定。结果表明,成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C转移载体。     

减蛋综合征病毒基因组不同酶切图谱的比较研究

分别应用限制性内切酶HindⅢ、Xba Ⅰ、Soc Ⅰ、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ对EDSV—gDNA进行单酶切以及以Hind Ⅲ为参照，选用适当内切酶进行双酶切，经对酶切图谱比较分析，以确定基因组中各酶切位点数及在Hind Ⅲ片段上的位置。结果表明：HindⅢ、Xba Ⅰ、Soc Ⅰ、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切片段分别为9、2、2、5、4、4条，Hind Ⅲ Xba Ⅰ、Hind Ⅲ Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ Sac Ⅰ、Hind Ⅲ BamH Ⅰ及Hind Ⅲ XEcoR Ⅰ分别为10、10、11、11和13条，为进一步研究禽类腺病毒的分子生物学特性和构建腺病毒表达载体奠定了良好的基础。     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

山羊痘病毒P32基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,用特异性引物扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,连接于pMD18-T载体,转化到JM109感受态细胞,对重组质粒双酶切、PCR鉴定与序列分析得出:P32结构蛋白基因全长969 bp,编码323个氨基酸.与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因序列同源性分别达99%和97%;与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因编码的氨基酸同源性分别达98.9%和96%.     

法氏囊B细胞λ轻链基因编码蛋白在大肠杆菌中的表达

为获得鸡λ轻链基因的表达蛋白,采用聚合酶链反应从鸡法氏囊B细胞cDNA文库中扩增出分泌表达蛋白的编码基因;用限制性内切酶消化后,插入克隆载体pUC19中。经PCR鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于原核表达载体PET43a的相应酶切位点。经过基因序列测定、BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实克隆载体正确插入载体PET43a。转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE分析表明目的蛋白得到表达;且能与His-Taq单抗相结合。     

含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒Fa株重组猪细小病毒VP2基因表达载体的构建

分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切含PRVFa株gI片段的质粒pPI,补平连接后得到去除EcoRⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点的大小约5.7kb的质粒pPI-2,再以CMV早期启动子控制的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因,将其插入pPI-2中gI基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点,构建了以gI为同源序列含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP。然后根据AnaI.Ranz等报道的猪细小病毒(PPV)NADL-2株的序列,设计一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物,扩增得到VP2基因后,将其插入转移载体质粒pPI-2.EGFP中,首次构建了含PPVVP2基因及其EGFP报告基因的PRV基因缺失转移载体质粒pPI-2.EGFP.VP2,为进一步构建PRV重组PPVVP2基因活载体疫苗奠定了基础,同时EGFP的引入也为进一步研究PRV在机体内的定植和感染机理打下了基础。     

牛乳铁蛋白抗菌肽(Lactoferricin)基因的克隆与表达质粒构建

按大肠杆菌偏爱密码子设计了牛乳铁蛋白肽的3段引物序列,通过PCR合成BeL1-2-3,经双酶切后克隆入pED质粒的BamHⅠ和HindⅢ位点之间,构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体,转化至E.coliBL-2(1 DE3),获得牛的乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆菌经诱导后,可表达出可观的融合蛋白,且表达量与诱导时间呈一定相关性。     

猪TLR7基因胞外区部分片段的克隆、表达及其重组蛋白的纯化分析

[目的]获得高表达量的蛋白,为进一步研制单克隆抗体提供较好的免疫原,同时也可为TLR7胞外区该片断蛋白未知区域的结构和功能研究奠定基础。[方法]应用PCR技术从重组质粒pcDNA3．1／CT-GFP-pTLR7上扩增出编码猪TLR7基因胞外区N端第27—202位氨基酸序列,利用BamHI和HindⅢ酶切位点将其插入到原核表达载体PE130a中,重组质粒转化BL21（DE3）后,在不同条件下诱导表达。[结果]经SDS．PAGE分析表明,重组菌表达出约26kD的融合蛋白,并证实主要以包涵体形式表达,其最佳诱导表达条件是37℃、0．5mm01／LIPTG诱导6h,表达量可接近50％;纯化的重组蛋白免疫小鼠后,间接ELISA检测抗体效价,结果该蛋白免疫BALB／c小鼠效价达10^5．[结论]TLR7胞外区该片断重组蛋白具有很好的抗原性,可以作为单克隆抗体研制的免疫原。     

猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达

依据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)BJ/YT株gD基因设计引物,扩增gD蛋白抗原表位,其设计扩增长度为702 bp,将扩增片段克隆到p MD19-T载体获得p MD19-T-gD。利用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切p MD19-T-gD质粒,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段,将回收片段与原核表达载体p ET-28a连接,成功构建了p ET-28a-gD表达载体。将表达载体转化感受态细胞Rosetta,IPTG诱导表达后,进行SDS–PAGE电泳,结果显示,在25 ku处出现特异性蛋白质条带。Western blot分析结果表明,表达产物能够被PRV的阳性血清识别。综上,成功克隆并表达了gD蛋白抗原表位,且其表达产物具有较好的生物学活性。     

p E G F P - N 3 - L P L重组真核表达载体的构建及在V e r o细胞中的表达

目的:构建贵州白香猪LPL基因与增强型绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pEGFP-N3-LPL,转染Vero细胞,观察重组质粒的表达.方法:采用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶获得LPL基因编码区片段和pEGFP-N3线型载体,将目的片段与该载体连接、转化、挑取阳性克隆,进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定.使用Lipofectamine2000将重组质粒转染Vero细胞,观察细胞中绿色荧光蛋白的表达并对其进行mRNA检测.结果:成功构建重组真核表达载体pEGFP-N3-LPL,经mRNA检测,实验组在1 500bp处出现特异性条带,说明重组载体已在Vero细胞中获得表达.结论:本试验构建的真核细胞表达载体pEGFP-N3-LPL,为进一步阐明LPL基因与肌内脂肪沉积间的生物学作用机制奠定了基础.     

抗除草剂bar基因植物表达载体的构建与抗性功能的检测

摘要：根据GenBank上发表的抗除草剂har基因序列设计引物,通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,获得har基因片段,连接在pMD18-T中间克隆载体上,用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切后连接到pBI121上获得pBI121-bar。用HindⅢ内切酶切含Bt-4AB基因的质粒并与pBI121-bar重组,重组质粒命名为pBI121-bar／Bt。重组质粒导人农杆菌LBA4404工程菌中,转化新海24号棉花胚性愈伤组织。PPT抗性实验证明,构建的pBI121-bar／Bt载体获得抗除草剂抗性,并筛选出PPT临界筛选浓度为3．0mg／L。     

猪瘟病毒Npro基因的克隆表达

 为了得到一个表达Npro蛋白的真核表达载体,从而为下一步研究不同时间段细胞主要组织相容性复合体（MHC）表达的变化情况,从分子水平上说明Npro与MHC之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应（RT PCR）技术对猪瘟病毒石门毒株Npro基因进行了克隆和测序,结果得到了长度为592bp的目的片段。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶分别对重组克隆质粒和转移载体pcDNA30进行双酶切,回收目的基因DNA片段,将目的基因Npro亚克隆至真核转移载体pcDNA30中,经双酶切和序列测定鉴定插入基因和连接方向正确,得到含完整Npro基因的重组载体质粒P Npro。构建成功的真核表达载体以脂质体介导的转染方法将此重组载体质粒转染PK 15细胞,转染24和48h后检测表达情况。经Western blot方法检测表明,此Npro蛋白在PK 15细胞中正确表达。     

鹅SCD1基因真核表达载体构建及在肝细胞中的表达

构建硬酯酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA Desaturase l,SCD1)真核表达质粒pcDNA3.1(+)/SCD1,转染鹅原代肝细胞验证其对细胞中脂肪代谢的影响。根据鹅SCD1基因设计带有酶切位点引物,RT-PCR扩增SCD1基因,克隆至pMD-19T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,构建重组真核表达载体pCDNA3.1(+)/SCD1。酶切及序列测定测序正确后转染鹅原代培养肝细胞,荧光定量PCR检测SCD1基因的表达,并用油红O染色检测细胞中脂滴情况。结果:成功构建SCD1基因真核表达载体,转染鹅原代培养肝细胞后SCD1基因获得了表达,与脂肪代谢相关基因SREBP表达上调,同时检测到细胞中脂滴明显增多。结论:构建了重组质粒pCDNA3.1(+)/SCD1,并在鹅原代培养细胞中获得表达,为进一步研究SCD1基因在鹅肝脏脂肪代谢中的作用奠定基础。