中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA 方法对采自中国14个省（直辖市）马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省（直辖市）代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法（Bayesian inference,BI）重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小（约800 bp）的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。     

大麦黄矮病毒PAV河南分离物通读蛋白ORF5基因的分子特征分析

利用RT-PCR从河南各地采集的110份小麦病样上鉴定出28个大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruse,BYDV)PAV分离物,并获得了这28个分离物的通读蛋白(Read through protein, RTP)ORF5基因全长.通过氨基酸序列比对可知,河南分离物RTP-ORF5基因变异普遍较大,28个BYDV-PAV河南分离物RTP-ORF5基因之间的核苷酸序列一致性为75.9%～100%,氨基酸序列一致性为79.4%～99.8%,核苷酸和氨基酸的一致性变异都较大.与国内外报道的16个BYDV-PAV通读蛋白基因相比对,其核苷酸序列一致性为72.2%～99%,由此推导的氨基酸序列一致性为77%～99.6%.系统进化分析显示河南地区分离物在4个内组群中都有分布.这些数据说明河南的大麦黄矮病毒PAV多样性丰富.     

黄瓜花叶病毒贵州辣椒分离物外壳蛋白基因序列分析

[目的]分析贵州辣椒主产区黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物的分子变异情况,为抗病毒辣椒品种选育及辣椒病毒病的防控提供科学依据.[方法]以来自贵州省8个县(榕江、大方、石阡、安龙、绥阳、德江、关岭和惠水)的16个辣椒CMV分离物为材料,采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)扩增辣椒CMV分离物的CP基因序列,利用DNAMAN和BioEdit对CMV分离物的CP基因序列进行比对分析,用MAGE 7.0的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树,分析贵州辣椒CMV分离物的遗传多样性.[结果]将16个贵州辣椒CMV分离物的CP基因核苷酸序列及编码蛋白氨基酸序列与CMV亚组代表株系进行一致性比对,结果表明,贵州辣椒CMV分离物与CMV亚组分离物的CP基因核苷酸序列一致性为89.7%~100.0%、CP蛋白氨基酸序列一致性为96.8%~100.0%.系统进化分析结果表明,CMV-DF、CMV-RJ、CMV-SQ、CMV-SY、CMV-DJ与CMV I代表株系聚为一个亚支,但更趋近于CMV亚组IB株系,CMV-HS、CMV-GL、CMV-AL与CMV亚组Ⅱ株系聚为另一个亚支,说明侵染贵州辣椒的CMV株系有两大组群,其中大方、榕江、绥阳、石阡和德江CMV分离物归属于CMV亚组IB株系,惠水、关岭和安龙CMV分离物归属于CMV亚组Ⅱ株系.[结论]不同地域的贵州辣椒CMV株系发生了变异.     

大麦黄矮病毒运动蛋白基因克隆及原核表达

[目的]构建大麦黄矮病毒运动蛋白（BYDV-MP）基因的原核表达载体,并在E.coli-BL21中进行高效表达。[方法]根据GenBank中收录的大麦黄矮病毒PAV6株系的基因序列设计合成1对引物,应用RT-PCR技术从感染大麦黄矮病毒的叶片中扩增得到大麦黄矮病毒（BYDV）的运动蛋白（MP）基因,利用基因重组技术构建pGEX-4T-1-MP,将其转化至大肠杆菌表达菌株E.coli-BL21（DE3）中,用IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1-MP在E.coli-BL21中进行表达。[结果]对重组质粒进行酶切分析及序列测定,鉴定正确后,与GeneBank中收录的大麦黄矮病毒PAV6株系的MP基因序列比对分析,同源性达100%。在IPTG诱导下,高效表达出相对分子质量约43 kD的蛋白,蛋白质电泳（SDS-PAGE）结果表明,表达的蛋白条带与预期的GST-MP融合蛋白相符。[结论]成功构建了pGEX-4T-1-MP的原核表达载体,在E.coli-BL21中高效表达了MP,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

郑州地区小麦黄矮病病原鉴定及其外壳蛋白的分子进化分析

为了明确郑州地区小麦黄矮病病原种类及其分子变异情况,根据已公布的小麦黄矮病致病毒株GAV,GPV和PAV的外壳蛋白(CP)全长基因序列,采用RT-PCR方法鉴定了来自郑州地区的4个分离物种类,并进行了基于CP序列的郑州分离物与6个国内和3个国外分离物的进化关系分析.结果表明,郑州地区的4个分离物均鉴定为BYDV-PAV(命名为PAV-ZZ),其编码的CP与国内及国外的分离物,在核苷酸水平上的一致性为81%～99%.PAV-ZZ CP与济南分离物一致性最高,核苷酸水平上达99%;与昆明和德国、瑞典、美国分离物一致性较低,核苷酸水平上仅为81%.这表明BYDV-PAV郑州分离物与北方地区的病毒分离物可能有着相似的系统进化特征,而与南方地区及国外分离物在系统进化上有较大的差异.     

地黄病毒病的检测与初步鉴定

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法，对感染地黄病毒病的地黄进行检测和初步鉴定，并结合该病毒地黄分离物CP基因的克隆及序列分析进行验证。结果表明，烟草花叶病毒（TMV）为侵染地黄的主要病毒；扩增产物序列测定结果表明：TMV地黄分离物CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的TMV其他株系CP基因核苷酸序列的同源性在85％～98％之间，氨基酸序列同源性在84％～98％之间，同源性较高。根据不同株系CP基因氨基酸序列进化树分析，推测该分离物可能为TMV的已有株系。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

玉米矮花叶病病原河北株系的分子鉴定和外壳蛋白基因的序列分析

从河北省石家庄地区田间表现典型的矮花叶症的玉米病叶中得到分离物MD-HB,按照报道的马铃薯Y病毒属CP基因前后保守区序列的比较,设计合成了一对引物,采用RT-PCR法扩增了1 2kb的全长外壳蛋白(CP)和病毒基因组的3′末端非编码区(3′-URT)的cDNA序列,将其克隆到pGEM-T载体上,并进行序列分析。结果表明,CP基因由939个碱基组成,编码313个氨基酸并含有与蚜虫密切相关的DAG(Asp-Ala-Gly)序列。Nib/CP基因交界处的蛋白酶切位点为Q/S。与侵染禾本科作物的马铃薯Y病毒属甘蔗花叶病毒亚组的4种病毒代表株系甘蔗花叶病毒(SCMV-Ger)、SCMV-MDB、玉米矮花叶病毒(MDMV-A)、高粱花叶病毒(SrMV-H)和约翰逊草花叶病毒(JGMV-O)对应的序列进行比较,结果核苷酸序列的同源性依次为94 4%、84 3%、67 5%、74 2%和60 1%,氨基酸序列的同源性依次为95 5%、87 9%、67 1%、70 3%和58 8%;另一方面,此病毒分离物与来自甘蔗的SCMV株系SCMV-A和MDMV-SC的核酸序列及氨基酸序列的同源性分别为82%、81 1%和83 1%、82 8%,说明它们具有较远的亲源关系。认为应将我国SCMV玉米分离物单独从SCMV划分出来,作为SCMV亚组的一个新病毒种而不是SCMV的一个株系。     

江苏省葫芦科作物西瓜花叶病毒的分子鉴定和序列分析

[目的]对江苏各地具典型褪绿花叶症状的多种葫芦科作物是否为西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）侵染进行分子鉴定,明确该病毒在江苏的遗传分化.[方法]提取样品总RNA,利用西瓜花叶病毒的cp基因特异性引物进行RT-PCR扩增,克隆测序,应用DNASTAR和Clustal X软件进行序列分析.[结果]来自南瓜、瓠瓜、西瓜和西葫芦的11个分离物的RNA模板中均检测到1200 bp左右的片段;序列测定表明该片段含1154个核苷酸,包含完整的编码281个氨基酸的WMV-cp基因.序列比对结果表明,11个分离物和来自不同地区的17个分离物WMV-cp基因核苷酸和推导的编码CP蛋白氨基酸序列同源性分别为90.5％～100.0％和92.9％～100.0％.[结论]WMV的遗传变异与地缘相关性较强而与寄主相关性较弱.江苏分离物WMV-CP氨基酸均具有蚜传株系的特征结构域DAG,暗示其田间流行与蚜虫有关.     

青海省部分地区马铃薯Y病毒cp基因序列分析

马铃薯Y病毒(PVY)是危害我国马铃薯的主要病毒之一,其在自然条件下极易发生基因变异而产生株系分化现象。为揭示青海马铃薯Y病毒分离物cp基因的分子变异,利用RT-PCR方法扩增获得了16个马铃薯Y病毒分离物的cp基因序列,采用SDT、DANMAN、RDP和MEGA软件对其进行分子变异分析。序列一致率结果表明,16个分离物的核苷酸序列均为801个碱基,一致率为98.0%~100%,编码267个氨基酸,一致率为94.8%~100%。重组分析表明,16个分离物未发生基因重组。系统发育分析发现,11个分离物与PVY^N-Wi株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近,占被检出病毒分离物的68.7%;另外5个分离物与PVY^O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^O株系亲缘关系最近;未发现PVY^C株系、PVY^N株系、PVY^E株系和PVY^NTN株系存在。     

传染性法氏囊病病毒的分离及其VP2高变区序列的比较

[目的]从病鸡中分离传染性法氏囊病病毒(IBDV),并对其VP2基因高变区序列进行比较。[方法]采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种SPF鸡胚的方法分离到2株IBDV。对分离株(vVP2)进行扩增和序列测定,分析分离株的关键氨基酸位点特征,并与参考毒株相应序列进行同源性比较。[结果]2株分离株特征性位点的氨基酸为222A、249Q、254G、256I、279D、284A、294I和299S,属于wIB-DV的特征,与wIBDV参考株具有较高的同源性,其核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%～97.0%和98.7%～99.4%。从遗传进化树来看,2个分离株与参考的vvIBDV也在一个分支。此外,2个分离株表现出与该鸡场常用的疫苗株MB有较高的同源性,其核苷酸和氨基酸同源性分别为96.8%和98.1%,并在遗传进化树中同属于一个大分支,但其特征性位点的氨基酸明显不同。在其他氨基酸位点上,2个分离株均发生了D212N的特有变化。[结论]该鸡群感染的IBDV具有vvIBDV的分子特征,并发生了与疫苗株和参考株不同的分子变化。     

貂、貉源犬瘟热病毒流行毒株H基因的克隆及遗传多样性分析

为研究鼬科动物犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)毒株的变异特性,对分离自不同地区貉、貂的5个CDV毒株和1个CDV国内弱毒疫苗株(vacChina)的H基因进行了核苷酸测序,并与12个参考毒株构建系统发生树。结果表明:5个流行毒株之间H基因核苷酸序列同源性均达到97.5%以上,vacChina与5个流行毒株的H基因核苷酸序列同源性普遍较低(90.5%～91.8%),而与国外疫苗株Convac和Onderstepoort的H基因核苷酸同源性达96.8%和97.2%。流行毒株之间H蛋白氨基酸同源性差别不大(97.1%～100.0%),流行毒株与vacChina疫苗株H蛋白氨基酸同源性普遍较低(89.7%～91.8%),vacChina与Onderstepoort、Convac有着很高的同源性,其H蛋白氨基酸同源性分别为97.1%、95.6%。结果分析显示,CDV的流行和免疫失败现象的发生与国内所用疫苗毒株和野毒株的遗传关系甚远有关。     

锦鲤维氏气单胞菌感染症及其病原生物学特性研究

[目的]报道锦鲤的发病情况及其病原的主要生物学性状。[方法]对5尾发病及新鲜病死的锦鲤病变组织进行细菌检查及分离,对分离菌进行形态特征、理化特性等表观分类学指征鉴定;同时择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定、健康锦鲤的人工感染试验和药敏试验。[结果]根据2株分离菌的形态特征及理化特性,结合16S rRNA序列测定与系统发育分析结果,判定其为气单胞菌属的维氏气单胞菌,其代表菌株HC050630A-1的16S rRNA基因序列长度为1457bp。人工感染试验表明,HC050630A-1株具有较强的致病作用。药敏试验结果显示,HC050630A-1菌株对供试37种抗菌药物中的头孢拉定等16种高度敏感,对头孢唑啉等13种敏感,对青霉素G等8种药物耐药。[结论]该研究为对该病的有效检验与防制等提供参考。     

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

 【目的】阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性，为疫苗研制提供指导。【方法】利用PCR技术，扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因，并进行克隆、测序及序列分析。【结果】发现7株类M基因长度为1 137 bp，含一个阅读框，CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1 143 bp及1 125 bp。除1株关节炎分离株CP-0104外，引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%，推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源；除CP-0104外，其余8株高变区高度同源。【结论】国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。     

黑曲霉中国株(3.758)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆与结构分析

[目的]为充分开发黑曲霉在轻工业中的用途。[方法]以黑曲霉中国株(3.758)基因组DNA为模板,用LATaqDNA聚合酶对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,扩增片段纯化后与pUCm-T载体连接后,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经琼脂糖凝胶电泳法、酶切和PCR鉴定获得阳性克隆。对获得含GOD基因的克隆进行测序,分析其蛋白质氨基酸序列及限制性内切酶的图谱。[结果]经PCR扩增获得约1.8kb的片段。获得的GOD基因编码序列共1818bp,与报道的黑曲霉(ATCC9029)GOD基因序列仅有3个碱基之差。该基因序列具有多个限制性内切酶位点。黑曲霉不同菌株与中国株(3.758)GOD基因的同源性比较表明,不同黑曲霉菌株中GOD基因不同,而菌株ATCC9029与菌株NRRL-3是同一菌株。[结论]该研究获得了GOD基因的全长序列,为GOD的生物工程生产和相关植物基因工程奠定了基础。     

PRRSV Hr-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础.     

部分鸡场致病性葡萄球菌的分离·鉴定·药敏试验

[目的]从合肥地区部分养鸡场病鸡组织中分离葡萄球菌,并对其进行鉴定和药敏试验。[方法]从合肥地区部分养鸡场病鸡组织中分离葡萄球菌,并通过形态特征观察、溶血性试验、血浆凝固酶试验、生化试验对其进行鉴定,最后对其进行药敏试验。[结果]共分离到9株葡萄球菌。经鉴定,其中4株为金黄色葡萄球菌,在临床分离的葡萄球菌中为优势群株;在凝固酶阴性葡萄球菌中2株为头状葡萄球菌,孔氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌和沃氏葡萄球菌各1株。这说明金黄色葡萄球菌是合肥地区家禽养殖场中葡萄球菌类疾病的主要病原菌。药敏试验结果表明,所有分离菌株对12种临床常用抗生素均呈不同程度的耐药性,对青霉素、复方磺胺甲噁唑和恩诺沙星有较高的耐药性。凝固酶阴性葡萄球菌与金黄色葡萄球菌在抗药性方面存在差异。[结论]在用抗生素防治葡萄球菌病时需通过药敏试验进行药物筛选。该研究结果可为养鸡场用药提供参考。     

大麦黄矮病毒株系间分子变异与系统进化关系研究

对已公布的45条大麦黄矮病毒( Barley yellow dwarf virus,BYDV)全基因组进行比对分析,表明BYDV具有2种基因组结构类型.依据45条全基因组序列和59条外壳蛋白(CP)基因序列分别建立BYDV系统进化树,表明PAV株系可分为3个亚组,且发现中国的PAV与欧美的PAV间存在明显的分子差异.M...