河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。     

马铃薯PLRV病毒宁夏分离物外壳蛋白基因CP的克隆与序列分析

利用双抗体夹心酶联免疫吸附法分离得到了PLRV宁夏分离物,并采用RT-PCR技术分离得到了宁夏分离物外壳蛋白基因CP的核苷酸序列,PLRV CP基因共624 bp,推测编码208个氨基酸残基,分子量大小为23234.2,等电点11.85.通过同源性分析,其与2013年内蒙古分离物(KC456052)最为接近,同源性达99.8％;进化树分析发现其有一定的地理区域性,为单独分支起源.     

西瓜花叶病毒2号山西分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法，扩增获得西瓜花叶病毒２号（ＷＭＶ－２）山西分离物ＣＰ基因，并克隆到ｐＵＣ－Ｔ载体中，核苷酸序列测定结果表明，山西分离物ＣＰ基因全长为８４６个核苷酸，编码由２８１个氨基酸组成的３１．５ｋＤａ蛋白。与国外已报道的ＷＭＶ－２ＣＰ基因相比，其核苷酸序列同源性为９２．８％～９３．９％，由此推导的氨基酸序列同源性为９５．４％～９６．４％，山西分离物外壳蛋白有４个氨基酸残基明显不同于其它分     

葡萄扇叶病毒外蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT－PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物（GFLV－H）基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段，并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector。序列分析结果表明，该基因含有1515个核苷酸，编码504个氨基酸，其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88％和95％。目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121，经三亲交配导入到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中。     

小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因的克隆与序列分析

用TRIZOL法提取了小卷蛾斯氏线虫RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)技术克隆了两条小卷蛾斯氏线虫β-微管蛋白基因cDNA的3′端序列。将得到的cDNA序列提交到GenBank,分别获取登录号EU049857和EU049858。两个序列长度分别为1372碱基(SCTUB1)和1374碱基(SCTUB2),分别编码434和432个氨基酸,编码的蛋白的分子量在48kDa左右。氨基酸的124~131位存在一个微管蛋白信号片段GGGTGSG。序列分析表明,分离得到的两个基因与其他线虫的微管蛋白基因具有较高的同源性,核苷酸序列同源性在65%以上,氨基酸序列同源性在81%以上,两个氨基酸序列都含有两个氨基酸保守区NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTE。     

高邮麻鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因克隆和植物表达载体的构建

用RT-PCR法从葡萄扇叶病毒杭州分离物(GFLV-H)基因组RNA中扩增了该病毒分离物的外壳蛋白基因cDNA片段,并克隆到质粒pGEM-T-easy Vector.序列分析结果表明,该基因含有1515个核苷酸,编码504个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸与GFLV法国分离物F13的同源性分别为88%和95%.目前该基因已成功地克隆到植物表达载体pBI121,经三亲交配导入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中.     

牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析

通过RT-PCR技术克隆牦牛SLC25A6基因的cDNA序列,并利用DNAMAN、MAGA 6、SWISS-MODEL、ExPASy等生物信息学软件系统对其进行分析。结果表明,扩增出的牦牛SLC25A6基因的编码区长897 bp,编码298个氨基酸;与普通牛、绵羊和人的相应基因核苷酸序列进行比对,序列一致性分别为99.33%、98.22%、91.86%;其编码蛋白分子量为32.821 ku,含多个修饰位点。     

猪HK2基因的克隆及序列分析

为克隆猪己糖激酶2基因,分析其生物功能,采用已报道的人及小鼠HK2的cDNA序列为依据,利用电脑克隆策略获得的ESTs设计引物,扩增新的猪HK2基因cDNA序列。将PCR产物克隆测序,分析获得的核苷酸序列及其编码蛋白的特性,分离的开放阅读框全长2754bp,编码917个氨基酸,与人和小鼠的核苷酸序列同源率分别为90%和87%,与人和小鼠的氨基酸序列同源率分别为96%和94%,利用生物信息学软件分析出此蛋白的理化特性并预测了其蛋白结构,为进一步开展猪HK2基因的结构功能、表达调控的相关研究奠定了基础。     

大豆特殊种子蛋白豆类胰岛素基因的克隆与序列分析

为了研究豆科植物豆类胰岛素基因的结构特征,以栽培大豆基因组DNA为材料,扩增并克隆了豆类胰岛素基因,克隆片段长度为841 bp。与cDNA 序列的比较结果表明,在信号肽编码区域内存在一个内含子,大小为368 bp;在豆类胰岛素的编码区域内,两者的核苷酸序列完全相同,而3′端非编码区域存在一个核苷酸差异。     

人类HBxAg蛋白反式激活基因5的原核表达及其蛋白纯化

为了更深入研究XTP5蛋白(也称人类次要组织相容性抗原(mHA-8))的生物学功能,以HepG2细胞总RNA为模板、应用RT-PCR技术获得XTP5基因,再利用基因工程技术对其进行克隆和原核重组表达载体构建和诱导表达,成功克隆XTP5基因,并成功构建原核重组表达空载体pET-32a(+)-XTP5;阳性重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21后,在37℃经终浓度1 mmoL/L IPTG诱导5 h后,受体菌大量表达76.88 ku XTP5重组蛋白;West-ern-blot证实宿主菌表达的蛋白特异性好;肝素亲和层析柱纯化表达产物XTP5蛋白效果良好。结果表明,成功克隆了人类XTP5基因,并获得纯度较高的融合蛋白XTP5。     

5～8周龄肉鹅能量和蛋白质营养需要量研究

以商品代豁眼鹅为供试动物,日粮的代谢能(M E)含量设置5个水平,分别为9.61,10.45,11.29,12.12和12.96 M J/kg,粗蛋白(CP)含量分别设为140,160,180和200 g/kg 4个水平,采用5×4因子设计进行饲养实验,研究了日粮能量和粗蛋白水平对肉鹅生产性能和胴体品质的影响。结果表明,(1)日粮M E水平对5~8周龄肉鹅平均日增重影响不显著(P>0.05),但对平均日耗料量和料重比影响极显著(P<0.01);日粮CP水平对5~8周龄肉鹅平均日耗料量和平均日增重影响均不显著(P>0.05),但对料重比影响显著(P<0.05);日粮M E水平为12.12 M J/kg,CP水平为160 g/kg时可获得理想的生产性能;(2)日粮M E和CP水平对肉鹅全净膛率,胸肌率,相对肝重和腿肌率影响均不显著(P>0.05),M E对腹脂率和皮脂率影响极显著(P<0.01),CP对腹脂率影响显著(P<0.05),对皮脂率影响不显著(P>0.05),M E水平与腹脂率和皮脂率间存在很强的正相关关系。通过本试验并结合生产实际认为,5~8周龄肉鹅适宜的能量和粗蛋白营养需要量分别为12.12 M J/kg和160 g/kg。     

鸡BPI氨基端的基因克隆和鉴定

应用RT-PCR技术,参照GenBank报道的预测序列,从鸡多形核白细胞(PMN)mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白(BPI) 氨基端95个氨基酸的基因片段,并与pMD18-T连接,构建BPI氨基端的基因重组体,进行酶切鉴定和序列测定.结果表明,获得了BPI N端长度为284 bp的基因片段,序列分析证实该片段中有3个点突变,但均不在活性中心.     

三化螟蜕皮激素受体和超气门蛋白基因的克隆和序列分析

利用RACE技术,根据已有的三化螟转录组数据,设计特异引物对三化螟的蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)基因进行克隆,获得了三化螟EcR和USP基因的全长序列。EcR基因全长2857bp,氨基酸序列包括545个氨基酸。USP基因全长共2082bp,氨基酸序列包括408个氨基酸。序列比对后发现,三化螟EcR和USP基因的氨基酸序列与已报道的鳞翅目昆虫EcR和USP基因的氨基酸序列具有很高的同源性,其中与二化螟的相似性分别达到94%和97%。序列分析表明,三化螟EcR和USP序列具有昆虫EcR和USP基因的特征结构:DNA结合域和2个锌指结构。     

新城疫病毒的基因组与结构蛋白特征

新城疫病毒属于副粘病毒科、Rubulavirus病毒属、Ⅰ型副粘病毒的惟一成员，为单股负链RNA病毒，整个基因组全长15586个核苷酸，编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素神经氨酸酶和高分子量的RNA聚合酶6种结构蛋白。为进一步做好新城疫的防治工作，对新城疫病毒的分子生物学特性，特别是对其基因组特征和编码蛋白的结构及功能等方面进行了较为详尽的综述，从而为新城疫病毒的深入研究奠定了一定的基础。     

岷县黑裘皮羊血液蛋白多态性的研究

采用不连续非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对42只岷县黑裘皮羊的血红蛋白(Hb)和转铁蛋白(Tf)基因座的多态性进行了研究。结果表明:岷县黑裘皮羊的Hb、Tf位点均存在多态性;Hb位点共检测到HbA、HbB和HbC 3个等位基因,共构成HbAA、HbBB、HbAC和HbBC 4种基因型,其中HbBB和HbB为优势基因型和优势基因;Tf位点共检测到TfBB、TfCC、TfAB、TfAC、TfAD、TfBC、TfCD 7种基因型,受TfA、TfB、TfC、TfD 4个复等位基因控制,其中TfCC和TfC为优势基因型和优势基因。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.     

日粮能量蛋白水平对肉仔鹅胴体性能和血液生化指标的影响

选用360只豁眼鹅雏鹅,代谢能(ME)设为10.87,11.37,11.87,12.37和12.87MJ/kg5个水平,粗蛋白(CP)含量设为150,175和200g/kg3个水平,采用5×3因子设计,共计15个处理,每处理6个重复,每重复4只试鹅,研究了日粮能量蛋白水平对肉仔鹅胴体性能和血液生化指标的影响。结果表明:(1)日粮ME水平极显著影响肉仔鹅全净膛率和腹脂率(P<0.01);日粮CP水平极显著影响肉仔鹅胸肌率和腿肌率(P<0.01);日粮ME和CP水平及其互作极显著影响肝相对质量(P<0.01)。(2)日粮ME水平对试验所测血液生化指标影响不显著(P>0.05);日粮CP水平对肉仔鹅血清中尿酸、总胆固醇和白蛋白的含量有一定影响,日粮ME和CP水平之间的互作极显著影响其血清白蛋白的含量(P<0.01)。     

中国实验小型猪朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已发表的猪朊蛋白基因（PRNP）序列设计特异性引物，进行PCR直接扩增，得到了中国实验小型猪（CEMP）的朊蛋白基因（PRNP），将其克隆到pGEM-TEasy载体中。序列分析表明上述CEMP的PRNP基因ORF区全长为774bp，编码257个氨基酸的前体蛋白，分子质量约为28．3ku，其PRNP序列与已发表的猪PRNP序列（L07623）差异微小，仅在第4位氨基酸残基处有变异（Ser→Asn）；绘制CEMP与其他15种属动物朊蛋白的氨基酸序列进化树发现，CEMP与多种哺乳动物朊蛋白的氨基酸序列遗传距离比较接近，与水貂最近。而与禽类朊蛋白氨基酸的遗传距离较远。     

蛋白核酸合成抑制剂对甜菜谷氨酰胺合成酶活性调控分析

在氮素诱导下,进行甜菜谷氨酰胺合成酶(GS)活性的测定,筛选出最佳的氮素诱导处理,研究核酸合成抑制剂放线菌素D和蛋白合成抑制剂放线菌酮对GS在酶活水平上的表达调控。结果表明,NO3-:NH4+=80:20处理时,GS活性最高,并且在此处理下放线菌素D和放线菌酮均能抑制GS活性。说明甜菜GS的表达可能在转录水平和翻译水平上均受到调控。