华中农业大学学报（自然科学版）第25卷 2006年总目次

生物技术SARS冠状病毒刺突蛋白S144-643的表达及免疫原性分析………………………………费小战卢海松郭红燕等(1)3个不同鸭种基因组DNA多态性的RAPD分析……………………………………………苏瑛刘楚吾叶昌辉等(6)弓形虫SAGⅠ基因的克隆与原核表达………………………………………     

SARS病毒S2蛋白基因重组腺病毒的构建与分析

编码SARS冠状病毒S蛋白(Spike protein)的C端序列S2较为保守,可作为SARS病毒疫苗研究的候选抗原基因.该研究拟构建基于SARS病毒S2蛋白的重组腺病毒疫苗并对其进行免疫学初步分析.首先通过非对称PCR方法,将人工合成的S2蛋白基因的两个片段f3和f4进行拼接得到完整的S2片段,利用Ad5腺病毒系统构建S2蛋白基因的重组腺病毒并在AD293细胞中包装成病毒颗粒,采用间接免疫荧光和蛋白免疫印迹法对S2蛋白基因的表达进行鉴定,然后用此重组腺病毒免疫小鼠对其抗体生长情况进行分析.免疫荧光和蛋白印迹分析结果显示,携带SARS病毒S2蛋白基因的重组腺病毒rAd-S2能在细胞中成功表达,表达的S2蛋白能被马抗SARS血清所识别.ELISA分析结果表明,用表达SARS病毒S2蛋白的重组腺病毒rAd-S2免疫小鼠,能有效刺激小鼠机体产生抗体,重组腺病毒免疫小鼠后所产生的抗体水平最高能达到104以上.可见通过对SARS病毒S2蛋白基因重组腺病毒的成功构建与免疫学初步分析,能为SARS疫苗研究奠定基础.     

SARS病毒E基因的克隆与重组腺病毒rAdE-E的构建

为了进一步研究SARS病毒E蛋白的功能以及在SARS致病机理中的作用,我们通过touch-down PCR程序,从SARS病毒WHU株(GenBank accession number AY394850.1) cDNA文库中扩增了E基因,并通过基因工程技术及腺病毒系统构建了重组腺病毒rAdE-E.DNA测序、酶切鉴定及荧光检测(GFP表达)结果均表明:重组腺病毒rAdE-E构建成功.     

SARS病毒S蛋白S1和S2片段的合成及在大肠杆菌中的表达

[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒SHpd/2012株S蛋白的表达鉴定

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种可致仔猪严重腹泻的高度接触性肠道传染病。S蛋白在病毒感染和入侵宿主细胞的过程中具有重要作用。为了研究S蛋白的特点,本研究扩增了PEDV新流行毒株SHpd/2012的纤突蛋白S基因分段片段S11、S12、S13、S21和S22,将得到的目的片段导入原核表达载体pGEX-6P-1中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、鉴定,获得了正确的PEDV S的分段蛋白S11(24-277aa)、S12(272-571aa)、S13(560-797aa)、S21(793-1109aa)及S22(1102-1384aa),为后续单克隆抗体的制备和致病机制的研究奠定了基础。     

猫血管紧张素转换酶2的三维结构模拟与真核表达

家猫能自然及人工感染SARS病毒,本研究旨在探讨家猫ACE2潜在的SARS病毒受体功能。以人血管紧张素转换酶2(ACE2)序列为模板,用同源模建法模拟了家猫ACE2的三维空间结构,发现家猫ACE2与人ACE2结构十分相似,其结合严重急性呼吸综合症(SARS)病毒囊膜纤突(S)蛋白的关键氨基酸的同源性很高(15/18)。将家猫血管紧张素转换酶2基因N端1-367 aa对应的基因片段及其跨膜区克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-his( )B中,构建了表达质粒pcDNA-mA367,转染HeLa细胞,间接免疫荧光检测表明fACE2的N端片段已在细胞膜上成功表达。     

SARS-CoV核衣壳蛋白的体外表达及单克隆抗体功能鉴定

为对SARS N蛋白的功能进行研究,并建立快速、方便的诊断方法,将已克隆、构建成功的重组质粒PGEX-4T/N转化至E.coli BL21中,IPTG诱导表达,表达产物与兔源GST多抗在66 kD处有很强的反应性,融合蛋白GST-N分别通过GSTrap FF 1 mL纯化柱和割胶纯化两种方法获得了具有生物活性和变性的融合蛋白.其蛋白浓度分别为0.85 mg/mL和0.433 mg/mL.利用纯化的GST-N蛋白免疫SPF BALB/c小鼠,获得4株能稳定传代并分泌抗SARS N单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞,分别命名为3E5、6B9、4C2、4B7,经Western blot分析表明,所获得的4株抗SARS N单克隆抗体与纯化的N蛋白均具有特异反应性,且不与禽冠状病毒的N蛋白发生反应.     

葡萄MrRPV1蛋白LRR结构域的功能研究

【目的】明确葡萄霜霉病抗性蛋白(MrRPV1)LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响,为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础。【方法】将MrRPV1和白粉病抗性蛋白(MrRUN1)两个蛋白的LRR结构域互换,构建重组表达载体后转化至感霜霉病和白粉病的欧亚种西拉葡萄胚性愈伤组织中以获得转基因植株,并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定。【结果】共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因(重组了MrRPV1蛋白LRR结构域)株系和6个RGA8-10LRR阳性转基因(重组了MrRUN蛋白LRR结构域)株系。在7个RGA10-8LRR阳性转基因株系中,仅RGA10-8-13阳性植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点,肉眼观察不到白色霜霉状物,但7个阳性转基因系均未表现出明显的白粉病抗性。在6个RGA8-10LRR阳性转基因株系中,RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性,有35%左右的细胞表现出细胞程序性坏死(PCD);RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病。【结论】MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别,而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别。     

β淀粉样蛋白(25-35)对AD大鼠海马Beclin-1表达及学习记忆的影响

研究β淀粉样蛋白(25-35)对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1的表达和学习记忆功能的影响。通过行为学以及免疫组织化学检测,观察模型大鼠学习记忆功能以及海马Beclin-1表达的变化。行为学检测表明:模型组的学习记忆功能明显低于正常组,模型组Beclin-1表达明显降低(P<0.01)。海马CA1区注射β淀粉样蛋白(25-35)大鼠学习记忆力下降,Beclin-1表达下调,提示Beclin-1蛋白的表达降低很可能是β淀粉样蛋白(25-35)致神经元可塑性降低的关键环节。     

嗜水气单胞菌表层蛋白及外膜蛋白的初步分析

用甘氨酸缓冲液处理对鱼类致病的嗜水气单胞菌代表菌株 Ah J-1菌体细胞,可使该菌表层蛋白(S层)成片脱落。电镜观察发现,S 层是由四边形的蛋白亚单位呈晶格样排列而成。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,该蛋白的分子量约50k;免疫印迹显示,它是 Ah J-1的主要表面抗原。另将 Ah J-1用 Triton X-100选择性抽提,经 SDS-PAGE,在考马斯亮蓝染色图谱中显示其外膜蛋白(OMP)为3条主要蛋白带,分子量分别为34,46和58k.     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析

[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。     

PCV2·ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]为了研究PCV2-ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化。[方法]用PCR方法扩增PCV2 ORF2基因3′端片段,PCR产物经酶切后与经同样处理过的pET32a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21感受态细胞;重组菌液用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。[结果]ORF2基因在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子量约为33 ku;在37℃、1 mmol/L浓度下,诱导时间为6 h时表达量最大,占细菌总蛋白的23.62%。表达产物主要以包涵体的形式存在,将包涵体溶解后过Ni-NTA柱纯化可得到较为纯净的目的蛋白。[结论]该研究为猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等疾病的防治奠定了基础。     

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(HgN2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9.将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代...     

玉米大斑病菌STK1原核表达载体的构建及其表达

【目的】构建玉米大斑病菌STK1原核表达载体并进行表达,以期得到带有His标签的目的蛋白。【方法】根据GenBank中STK1(AY849317)的cDNA序列及原核表达载体pET28a(+)中的多克隆位点设计引物,进行STK1的克隆和原核表达载体的构建。将重组载体在原核表达体系中进行表达。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达,并利用Western blot技术验证该蛋白是否为目的蛋白。【结果】STK1在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在;蛋白的分子量约为40.8kD;经1mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导,9h后蛋白产量达到最高;经Western blot检测该表达产物具有His-6抗原性。【结论】玉米大斑病菌MAPK信号转导途径中的STK1在大肠杆菌中获得了表达,为今后STK1蛋白的多克隆抗体制备及功能研究奠定基础。     

2种泥鳅生长激素基因cDNA的克隆和原核表达研究

从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆到了泥鳅和大鳞副泥鳅的生长激素(GH)基因cDNA,分析了其核苷酸序列和推测的氨基酸序列.结果表明:2种泥鳅生长激素基因的开放阅读框(ORF)均包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽.在cDNA序列上2者有11个核苷酸的差异;在蛋白质水平上,2者的差异仅为1个氨基酸,位于信号肽中,在成熟多肽中,2者的氨基酸序列相同.把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体.细菌裂解液沉淀溶于浓度为8mol/L的尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得了分子量为24 kDa的单一蛋白带.     

鸡类胰岛素生长因子Ⅰ的克隆、表达及其表达产物的生物学活性研究

 应用RT-PCR方法对雏鸡肝脏总RNA中鸡类胰岛素生长因子Ⅰ基因cDNA进行扩增，然后将特异性片段连接到pMD18-T载体，测序结果表明，与已知序列同源性为100%。然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达，经Tricine-SDS-PAGE分析，原核表达产物为7.6 kD的重组蛋白，占菌体总蛋白的23%，Western印迹表明重组蛋白具有IGF-Ⅰ抗原活性。表达产物以包涵体形式存在，经7 mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及0.5 mol·L-1精氨酸复性液处理，表达产物随后进行脱盐、凝胶层析纯化、MTT法分析其对NIH3T3和鸡胚成骨细胞的增殖效应，结果表明重组鸡IGF-Ⅰ具有较高的生物学活性。     

鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21 (DE3),在0.1 mmol·L-1 IPTG、37℃下诱导5h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再...     

鱼类病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因的原核表达

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清分别用于SDS-PAGE电泳,结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化,得到了较高纯度的可溶性蛋白。经Western-blot检测表明,该表达产物能被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。