转PRSV复制酶基因T2代番木瓜植株的抗病性测定

转PRSV复制酶基因的番木瓜植株，其自交及杂交二代植株经PCR检测和Southem-blot杂交的结果表明：目的基因整合在番木瓜的染色体上．人工接种PRSV的Ya、Vb、Sm株系于分子检测阳性的7～8叶期植株，转基因植株均表现高抗．在定植田间的9个月中，转基因植株无一发病，而对照则全部发病．     

番木瓜CpTIFY10A-like基因克隆及表达分析

[目的]克隆番木瓜CpTIFY10A-like基因序列,并分析其表达特性,为探索该基因功能和抗番木瓜环斑病毒(PRSV)分子机制提供理论依据.[方法]结合前期研究的抗PRSV转录组数据,利用RACE对上调表达基因Cp-TIFY10A-like进行克隆,获得该基因cDNA全长序列,分析其编码区序列(CDS)及进行生物信息学分析.利用已鉴定的PRSV对3月龄番木瓜植株进行不同处理,以感染PRSV且出现病症的植株(CK+)、1.0 mL/L禾甲安(CTS-N)灌施感染PRSV且出现病症的植株(B)为处理组,以清水灌施(不添加禾甲安)不感染PRSV的植株(CK-)为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同处理下PRSV基因和CpTIFY10A-like基因在番木瓜叶片中的表达情况.最后将CpTIFY10A-like基因CDS序列连接至pET28a-sumo载体上构建原核表达载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,通过不同浓度IPTG诱导蛋白表达,利用SDS-PAGE电泳检测原核表达情况.[结果]CpTIFY10A-like基因全长为1352 bp,CDS序列为822 bp,编码273个氨基酸残基;其编码蛋白理论等电点(pI)9.23,不稳定系数62.97,亲水性平均系数-0.458,属于不稳定的亲水性碱性蛋白,定位在细胞核上,其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,同时含有少量的β-折叠和延伸链.CpTIFY10A-like蛋白与酸枣和白梨TIFY蛋白的氨基酸序列相似性较高,均含有特定的TIFY结构域,属于TIFY蛋白家族,三者在系统发育进化树上聚在同一分支,表明亲缘关系较近.不同处理的番木瓜叶片中,PRSV基因的相对表达量排序为CK+(1.02)>B(0.39)>CK-(0),CpTIFY10A-like基因的相对表达量排序为B(53.12)>CK+(1.15)>CK-(1.02),且CpTIFY10A-like基因在经禾甲安处理的感染PRSV番木瓜叶片中相对表达量显著升高(P<0.05,下同),而PRSV基因的相对表达量显著降低.CpTIFY10A-like基因在原核细胞中表达蛋白的分子量与理论分子量(29.36 kD)相符,且不同浓度IPTG诱导下,IPTG浓度越高,蛋白表达量越多,表明该基因在原核细胞中成功表达.[结论]禾甲安可诱导CpTIFY10A-like基因高效表达,进而通过茉莉酸通路起调节作用以抵抗PRSV感染,即CpTIFY10A-like基因在番木瓜抗PRSV过程中发挥重要调控作用.     

抗环斑病毒番木瓜的开发技术及转基因对基因组影响研究进展

本文综述了番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus,PRSV)的生物学特性、防治措施及抗PRSV转基因番木瓜在国内外研究进展,通过基因转化对番木瓜基因组结构和功能的影响及外源基因整合主要技术方法等内容的阐述,展望了转基因番木瓜的研究前景.     

转基因番木瓜抗病性测定和纯合系的获得

分别对转番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）复制酶基因（Trp）的T3、T4代番木瓜（Carica papaya L．）品系在苗期进行攻毒试验和PCR分子生物学分析．结果表明，在苗期T3、T4代分子检测阳性株均高抗PRSV的Ys株系，证实Trp基因能够在后代中稳定遗传．除品系Trp-6-2外，其它所有T3、T4代自交植株仍有基因分离．Trp-6-2的自交株和其T4杂交后代，苗期攻毒试验均表现抗病，PCR检测复制酶基因均为阳性，所转基因没有发生分离，可以初步推定Trp-6-2为转基因的纯合系．大田病情调查结果表明，T3代在定植田间的前5个月内，转基因植株均高抗PRSV．但在定植5个月后发现一个转基因品系38株中有3株表现发病．     

人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi 表达载体…

番木瓜环斑病毒(PRSV)正引起番木瓜毁灭性严重病害,番木瓜叶扭曲花叶病毒(PLDMV)也在威胁着目前转基因番木瓜的推广和应用。通过人工合成包含PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和HcPro基因多个保守区域的靶序列作为模板,扩增两条长短不同但大部分重叠的靶序列,并通过引物设计时添加的特定酶切位点两个靶序列反向连接,形成以长靶序列的5’一部分序列作为发夹结构的环,不需要另外插入内含子序列的反向重复发夹结构的RNAi表达载体pPTN-LS。该方法构建的RNAi表达载体,不仅具有快速、稳定性高等优点,还能同时靶标PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列,能有效提高沉默效率,为利用RNAi技术培育广谱、高效、稳定且安全性高,同时抗PRSV和PLDMV病毒病的转基因番木瓜新种质的奠定基础。     

转番木瓜环斑病毒复制酶基因番木瓜的多重定性检测

为监测和管理转基因番木瓜华农1号的商品化生产、销售,建立了相应的转基因定性检测方法.选用木瓜蛋白酶作为番木瓜的内源对照基因,建立对转基因番木瓜PRSV-Rep基因、外源CaMV35S启动子序列、NOS终止子序列和NPTⅡ基因的常规PCR检测体系.退火温度为40～60℃时,都分别扩增出了清晰的目的基因.单基因常规PCR检测转基因模板量的下限为5×10-7g.建立的三重PCR检测技术,检测了包括NPTⅡ、Rep和CaMV35S;NPTⅡ、Rep和Nos;NPTⅡ、Rep和Papain等3个组合.建立了NPTⅡ、ReP、CaMV35S和Nos4个基因的四重PCR检测技术.     

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

【目的】构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体p BI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量。同时,提取叶片的RNA并反转录为c DNA,利用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况。取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析。【结果】克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体p BI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第15和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制。p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性。转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性。经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性。【结论】p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体。     

利用RT-PCR技术检测吊瓜病毒种类的研究

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaicvirus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)和番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是危害葫芦科作物最严重、最广泛的5种病毒。根据已知的5种病毒序列设计特异性引物,对感染病毒的吊瓜总RNA进行RT-PCR扩增。结果表明长兴吊瓜的病毒种类主要为PRSV,感染率为100%,无复合病毒感染。吊瓜植株不同取样部位(茎尖、卷须、嫩叶、茎、花、子房、老叶等)的RT-PCR表明老叶是较好的病毒检测取样部位,而嫩叶是吊瓜脱毒最佳的外植体取样部位。对茎尖的PRSV表达量高过幼叶的原因也进行了分析,认为可能是病毒的表达量与植株的代谢强度有关。     

抗PRSV转基因番木瓜研究进展

番木瓜花叶环斑病毒（PRSV）严重影响着热带亚热带的重要水果番木瓜的生产,在物理和化学防治措施效果不佳的情况下,利用病原获得抗性防治PRSV的方法给番木瓜的生产带来一线生机。综述了近年来转基因番木瓜中所采用的PRSV病毒的几个基因及其优缺点。     

抗TMV、CMV转基因烟草的初步选育

将烟草花叶病毒复制酶54 KD蛋白基因构建到质粒pSSZ32.54K,导入根癌农杆菌EHA105株系,用农杆菌介导的叶盘法转化含CMV CP基因的纯合系烟草,获得了含CMV CP基因和TMV RepE基因的转基因烟草,以及只含TMV RepE基因的转基因烟草.以繁殖于新鲜普通烟叶片上的TMV为毒源,机械摩擦接种含双基因的烟草和只含CMV CP基因的烟草.接种15 d后,观察植株发病情况,发现转双基因的烟草无花叶症状出现,而对照植株(只含CMV CP基因)出现花叶症状.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒含量,发现转基因植株体内无病毒积累,而对照植株体内有病毒积累.因此,含RepE基因的烟草对TMV有一定抗性.     

抗PRSV转基因番木瓜研究进展

番木瓜花叶环斑病毒（PRSV）严重影响着热带亚热带的重要水果番木瓜的生产，在物理和化学防治措施效果不佳的情况下，利用病原获得抗性防治PRSV的方法给番木瓜的生产带来一线生机。综述了近年来转基因番木瓜中所采用的PRSV病毒的几个基因及其优缺点。     

RNAi-mediated transgenic rice resistance to Rice stripe virus

Rice stripe virus(RSV) often causes severe rice yield loss in temperate regions of East Asia. Although the correlation of small interfering RNAs(si RNAs) with transgenic virus resistance of plants using RNA interference(RNAi) is known for decades, no systematical research has been done on the profiling of si RNAs from a genomic scale. Our research is aiming to systematically study the RNAi impact in RSV-resistant transgenic rice, which was generated by introducing an inverted repeat construct that targets RSV nucleocapsid protein(NCP) gene. In this paper, three independent RSV-retsistant transgenic rice lines were generated, their stable integration of the T-DNA fragment and the expression of si RNAs were confirmed by Southern blotting and Northern blotting analyses, and the majority of si RNAs were in lengths of 21, 22, and 24 nucleotides(nt), which have validated a connection between the presence of the RSV NCP homologous si RNAs and the RSV resistance in those transgenic rice lines. In one of these transgenic lines(T4-B1), the T-DNA fragment was found to have been inserted at chromosome 1 of the rice genome, substituting the rice genome fragment from 32 158 773 to 32 158 787 nt. Bioinformatics analysis of small RNA-Seq data on the T4-B1 line also confirmed the large population of NCP-derived si RNAs in transgenic plants, and the RSV-infected library(T4-B1-V) possessed more si RNAs than its mock inoculated libraries(T4-B1-VF), these results indicating the inverted repeat construct and RSV could introduce abundance of si RNAs in transgenic rice. Moreover, a varied expression level of specific si RNAs was found among different segments of the NCP gene template, about 47% of NCP-derived si RNAs reads aligned with the fragment from 594 to 832 nt(239 nt in length) in NCP gene(969 nt in length) in the T4-B1-V, indicating a potential usage of hotspot regions for RNAi silencing in future research. In conclusion, as the first study to address the si RNA profile in RSV-resistant transgenic plant using next generation sequencing(NGS) technique, we confirmed that the massive abundance of si RNA derived from the inverted repeat of NCP is the major reason for RSV-resistance.     

番木瓜CYP79A2基因片段的克隆与序列分析

苯丙氨酸氮羟化酶是植物中催化异硫氰酸苄酯(BITC)生物合成的第1个酶。笔者以番木瓜嫩叶总RNA反转录得到的cDNA为模板,依据拟南芥(NM-120608)和油菜(EU877074)的CYP79A2基因序列,并结合番木瓜的全基因组序列草图设计引物,进行PCR扩增,得到了大小为923bp的基因片段,命名为CP-CYP79A2。生物信息学分析结果表明,其为番木瓜的CYP79A2基因片段。为进一步研究番木瓜BITC的生物合成调控打下了良好的基础。     

转基因番木瓜“华农一号”事件特异性定性PCR检测方法的建立

以我国自主研发的转基因抗环斑病毒番木瓜"华农一号"为研究对象,应用TAIL-PCR技术,用载体中靠近右边界的Nos启动子序列设计特异引物,扩增插入的旁邻序列;根据测序结果,设计了产物长度分别为753和298 bp但均跨越转化载体和番木瓜基因组序列的2套特异引物,对"华农一号"进行检测,证明其可特异地把"华农一号"从转基因番木瓜品系中检测出来;2对引物的检测灵敏度都可以达到0.05%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求;利用2对特异引物对"华农一号"的果肉、果皮、种子进行检测,可得到特异性良好的扩增.     

云南番木瓜花叶病病原鉴定*

 西双版纳、保山、楚雄以及玉溪等地的感病番木瓜叶片表现为花叶或褪绿,叶片畸形,果实表面布满不规则线纹、环纹及环斑等症状。对感病番木瓜材料进行了电镜观察,在电子显微镜下观察到800nm左右的病毒粒子;设计PRSV特异性引物对感病番木瓜材料进行RT-PCR检测,获得的扩增产物和引物设计大小相符;利用双生病毒特异性引物没有检测到双生病毒。确定引起云南番木瓜花叶病的病原为番木瓜环斑病毒。     

木瓜酸奶制作工艺的优化

【目的】优化木瓜酸奶的制作工艺条件,为研制新型的果蔬酸奶及营养强化乳提供新途径。【方法】以木瓜和鲜牛奶为原料,以成品酸奶为发酵剂,加入蔗糖、稳定剂,经杀菌、冷却后发酵制备果汁型酸奶,并通过单因素试验和正交试验优化木瓜酸奶制品的工艺条件。【结果】木瓜酸奶的最佳原料配比为鲜牛奶∶木瓜汁∶蔗糖∶发酵剂（光明益生菌发酵乳）∶稳定剂（CMC∶明胶=1∶1）=100∶30∶12∶60∶0.2,生产工艺为40℃发酵7 h后放入4℃冰箱冷藏12 h。在最佳工艺条件下制备获得的木瓜酸奶酸度为90.02°T,含蛋白质含量3.09 g/100 g,Ca、Fe、Zn含量分别为121.75、3.8575和5.0275 mg/L。【结论】以木瓜和鲜牛奶为原料,以市售酸奶为发酵剂制备木瓜酸奶,其原料易得,方法简单可行,发酵时间短,尤其适合家庭式的生产制作。     

转基因柔嫩艾美耳球虫对生态环境的影响

【目的】从表达M2e-EYFP融合蛋白转基因柔嫩艾美耳球虫的稳定性,及其在环境中的传播能力、竞争能力和存活能力方面,分析转基因球虫对生态环境的潜在风险。【方法】稳定性试验包括:转基因球虫感染非靶动物,观察临床症状和卵囊产出情况;转基因球虫继代繁殖,检测荧光率;转基因球虫与毒害艾美耳球虫混合感染,PCR检测卵囊中的外源基因。传播能力试验主要是分析感染鸡和不感染同居鸡的卵囊产量和荧光率。竞争性试验则是用不同混合比例的2种球虫感染鸡,检测卵囊产量和荧光率;存活能力试验是用不同处理方式的卵囊感染鸡,检测卵囊是否产出以分析卵囊存活能力。【结果】转基因球虫不感染小鼠和家鸽,与野生型柔嫩艾美耳球虫宿主特异性相同;连续繁殖传17代后外源基因稳定表达。与毒害艾美耳球虫混合寄生时在异种球虫体内未检测出外源基因。传播能力试验中,46d攻毒时转基因球虫感染与不感染同居组的卵囊产量差异不显著,但与不感染对照组相比均显著减少,且1∶1感染和不感染同居组卵囊荧光率检测结果维持在51.6%67.9%。竟争性试验中,攻毒时各比例感染组卵囊产量均极显著少于不感染攻毒对照组,荧光率检测结果各比例组变化幅动不大,且1∶1组哨兵鸡卵囊荧光率检测结果为41.2%61%。存活能力试验,转基因球虫与野生型球虫在夏季室温条件下均不能存活90d,且与其他不同方式处理的卵囊外界存活时间接近。【结论】说明转基因球虫具有良好的稳定性,在环境中的传播能力、竞争能力和存活能力未呈现显著优于野生球虫的趋势。