基于荧光定量PCR技术分析滇池沉积物产甲烷菌空间分布特征

【目的】研究滇池沉积物产甲烷菌的空间分布特征。【方法】采集滇池草海和外海的4个不同面源污染区域沉积物,通过沉积物DNA提取、PCR扩增及产物纯化、质粒构建及阳性验证、标准曲线制作和荧光定量PCR方法,定量研究基于mcrA基因的产甲烷菌丰度及其分布特征。【结果】滇池沉积物产甲烷菌丰度范围为5.91×107～7.74×108 copies/g。产甲烷菌的拷贝数在各个采样区域差异显著(F=10.300 6,P=0.001 2),并具有空间分布特征,即外海中外海南草海外海北,且外海南部和中部的产甲烷菌丰度与草海和外海北部的产甲烷菌丰度具有显著差异(P0.05)。【结论】滇池沉积物具有较高的产甲烷丰度,且产甲烷菌在滇池的分布空间异质性很大,临近农业面源污染区域的外海中部和临近磷、钾厂的外海南部比草海和外海北部水华密集区具有较高的产甲烷菌丰度。     

应用克隆文库构建法研究枇杷根系AMF多样性

【目的】为进一步探寻和利用宝贵的AMF资源提供有效的研究方法。【方法】在昆明学院随机采集枇杷根系作为实验样品,采用CTAB法提取根系DNA,进行18S r DNA PCR扩增,产物连接转入大肠杆菌JM109受体,建立18S rRNA部分基因克隆文库。从文库中随机选取35个白色克隆子,经鉴定,获得30个阳性克隆子,将阳性克隆子测序。运用Mothur等软件分析阳性克隆子序列,确定9条差异序列,为不同的AMF序列。【结果】克隆文库的Coverage C值为93.3%,克隆文库的Shannon-Wiener指数为2.079,Simpson指数为0.87,且Rarefaction曲线比较饱和。9个序列分为了两个不同的类群,代表不同AMF种类;球囊霉属(Glomus)是枇杷根系的主要AMF类群,OUT1和OTU2代表了文库中的主要类型,其中OTU1为根内根生囊霉(Rhizophagus irregularis);OTU3、OTU4、OTU5和OTU6代表着文库中的常见类型;其余序列则为枇杷根系中的少见或稀有AMF类型。【结论】球囊霉属(Glomus)是枇杷根系的主要AMF类型,其中根内根生囊霉(Rhizophagus irregularis)为优势AMF种类。     

广州市流溪河沉积物反硝化细菌群落丰度与结构多样性研究

【目的】研究广州市流溪河沉积物中反硝化细菌的多样性,探讨环境因子对反硝化细菌群落结构和丰度的影响。【方法】通过构建基因文库和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对沉积物中反硝化细菌的群落结构和丰度进行分析,并结合主坐标分析(PCoA)和冗余分析(RDA)研究反硝化细菌群落与环境因子之间的相关性。【结果】流溪河流域不同采样位点沉积物中nirS型反硝化细菌的组成和丰度存在明显差异。沉积物中大多数nir S序列与已知的反硝化细菌亲缘关系较远,而与其他环境样品中的微生物亲缘关系较近,与流溪河沉积物中nirS反硝化细菌亲缘关系较近的物种有产黄杆菌属Rhodanobacter、副球菌属Paracoccus、Polymorphum gilvum、草螺菌属Herbaspirillum和陶厄氏菌属Thauera。氨氮(NH_4~+–N)和硝酸盐(NO_3~––N)含量对反硝化细菌群落结构起决定性作用。反硝化细菌nirS基因拷贝数范围为8.26×10~1~5.45×10~4 g~(-1),nirS型反硝化细菌数量与化学需氧量(COD)、总氮(TN)、NH_4~+–N、和NO_3~––N含量之间存在显著相关性。【结论】流溪河中化学污染物以及活性氮的大量存在显著影响了反硝化细菌群落结构和多样性。     

梭梭HaACT基因片段的克隆和3’UTR序列分析

【目的】以克隆HaACT基因为出发点,为进一步分析其表达特点奠定基础。【方法】根据NCBI上已发表的藜科其他植物肌动蛋白(Actin)序列的保守区设计一对简并性引物,以梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝为材料提取总RNA,采用RT-PCR法和3’RACE技术克隆了HaACT基因部分片段及3’UTR序列。【结果】得到HaACT基因片段1 107 bp,该序列编码257个氨基酸,3’UTR序列长度为416 bp。使用NCBI和DNAMAN软件对3’UTR序列进行了同源性分析。HaACT基因3’UTR序列与CaACT基因3’UTR序列的相似性高达93%,与BvACT基因3’UTR序列相似性为92%,与GhACT基因3’UTR序列相似性最低,为86%。【结论】HaACT基因与其他植物Actin基因可能具有相似的调控机制。     

中国弓形虫虫株529bp重复序列的PCR扩增、克隆及分析

 【目的】首次对中国来源于不同宿主、不同地域的9个弓形虫虫株(ZS1人株、PY猪株、GY猪株、ZC猪株、NT猪株、ZS人株、SH人株、CN猪株、QHO绵羊株)以及国际标准强毒RH株之间在529 bp重复序列的变异进行研究，从而为进一步的分子诊断和分子遗传学研究以及弓形虫病的防制奠定基础。【方法】抽提基因组DNA后，用PCR方法对10个虫株的529 bp重复序列进行扩增；扩增产物经纯化后克隆于pGEM-T Easy质粒载体，再经菌落PCR及酶切鉴定阳性克隆，然后对阳性克隆进行测序及序列分析。【结果】10个弓形虫虫株的529 bp重复序列都不完全相同，它们之间的核苷酸序列变异范围为0.8%～2.9%。变异主要位于第32～55位碱基之间,这些碱基变异与虫株的宿主来源、地域来源及毒力之间没有相关性。【结论】529 bp重复序列可作为遗传标记，用于弓形虫与其它寄生虫的种间鉴定，但不适合用于研究弓形虫的种内遗传变异。     

番茄WRKY转录因子基因片段的克隆及序列分析

【研究目的】本研究以番茄苗为实验材料,克隆出番茄WRKY转录因子的一个基因片段并对其核酸序列进行分析。【方法】根据本课题组已经克隆出的番茄特异的WRKY基因片段和番茄EST序列设计特异引物,利用RT-PCR技术获得番茄WRKY转录因子的一个基因片段并连接到pMD19-T载体中,转化DH5α,,筛选阳性克隆,用双酶切分析法对其进行鉴定并进一步对核酸序列进行测序分析。【结果】结果表明,克隆获得的WRKY转录因子基因片段约为680bp,用GenBank中的Blastn程序分析表明,其与CaWRKY（AY789641.1）、WIZZ（wizz mRNA）（AB028022.1）的相似性分别为86％和84％。【结论】WRKY转录因子在番茄中受JA诱导,这为克隆番茄WRKY基因全长,进而为番茄抗病育种奠定基础。     

玫瑰根系AMF 18S rRNA基因克隆文库构建及分析

【目的】本文研究了玫瑰根系的AMF多样性和组成结构。【方法】从昆明学院种质资源圃随机采集玫瑰‘卡罗拉’3株,采用CTAB法提取根系DNA,运用巢式PCR扩增AM真菌部分18S rRNA基因区域,扩增产物混合后构建克隆文库,最终确定30个阳性克隆子测序,并对文库进行评价和分析。【结果】文库Coverage C值为80%,但Rarefaction曲线不够饱和,应加大文库克隆子数目;文库多样性参数香农指数和辛普森指数分别为1.432和0.25,物种丰富度为4.0;以98%为界,30条序列被划分为15个OTU,均为Glomus的种类;其中OTU1是文库中的主要类型,OTU2~OTU9代表了常见类型,而OTU10~OTU15为稀有类型;有10个OTU在系统进化树上单独聚类,代表着Glomus较为新颖的种类。【结论】在玫瑰根系发现的15个OTU全为Glomus的种类,其中主要类型1种,常见类型8种,稀有类型6种,具体分类地位均不清楚。     

大麦幼穗MLOC-14401基因编码区的同源克隆和序列分析

【目的】编码区序列是基因作用机制、遗传多样性和进化关系等研究的重要资源。【方法】以盐城红茎大麦、青田红大麦、淳安六棱胭脂大麦和北青7号为材料,采用同源克隆技术分离、克隆MLOC-14401基因CDS序列,利用ORF Finder、BLAST和Clustal X等软件分析所克隆的CDS序列。【结果】MLOC-14401基因CDS序列全长1 248 bp、包含3个外显子、GC含量为62.82%,位于大麦3H染色体的609 892 778~609895 303 bp区间,起始密码(ATG)和终止密码序列(TAA)分别位于119 bp和1 366 bp位点。所编码多肽链包含415个氨基酸、2个MYB结构域,与普通小麦等9个物种的MYB基因编码多肽链具有不同程度的氨基酸序列相似性,保守序列位于105氨基酸与237氨基酸之间。【结论】MLOC-14401基因属大麦转录调控基因R2R3-MYB,所克隆的CDS序列对于大麦MYB基因作用机制等研究具有一定指导作用。     

大花杓兰根际土壤真菌及兰科菌根真菌多样性分析

【目的】从分子水平上对兰科杓兰属大花杓兰根际土壤真菌群落组成及潜在兰科菌根真菌进行初步研究。【方法】采用克隆文库技术对大花杓兰根际土壤真菌的ITS片段进行PCR扩增、克隆测序及BLAST分析。【结果】共获得96个真菌克隆,其中44个克隆鉴定为未知真菌,52个真菌克隆基于97%的序列相似性被划分为24个操作分类单元(Operational Taxonomic Unit, OTU),属于5门6纲11目16科15属。被孢霉属Mortierella为大花杓兰根际土壤的主要真菌类群。综合兰科植物菌根真菌的研究报道,对24个OUTs进一步分析,发现4个OTUs为潜在的兰科菌根真菌,分别属于角担菌科Ceratobasidiaceae的丝核菌属Rhizoctonia(OTU1)和角担菌属Ceratobasidium(OTU2)及胶膜菌科Tulasnellaceae(OTU3和OTU4)。【结论】根际土壤真菌及潜在兰科菌根真菌类群的构成及多样性研究,对从土壤中分离筛选有效的大花杓兰菌根真菌及其野生种群的迁地保育均具有重要意义。     

PCR-DGGE技术在水牛瘤胃产甲烷菌多样性分析中的应用

【目的】分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性,为更好地了解水牛瘤胃产甲烷菌提供科学依据。【方法】采集16头广西本地沼泽型水牛瘤胃内容物,提取总DNA,利用产甲烷菌的通用引物扩增16SrRNA基因序列进行DGGE分析,并对DGGE凝胶上7条优势条带进行回收克隆测序。【结果】共获得9条序列（5条为古菌序列、4条为非古菌序列）,5条古菌序列中有3条与甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）的同源性高达99%、1条与甲烷短杆菌的同源性达98%、1条与广古菌门（Euryarchaeota）热原体目（Thermoplasmatales）的同源性达98%;而4条非古菌序列分别属于拟杆菌（Bac-teroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）,且彼此间同源性较小。【结论】通过PCR-DGGE技术可以较好地分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性。     

PCR-DGGE技术在水牛瘤胃产甲烷菌多样性分析中的应用

【目的】分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性,为更好地了解水牛瘤胃产甲烷菌提供科学依据。【方法】采集16头广西本地沼泽型水牛瘤胃内容物,提取总DNA,利用产甲烷菌的通用引物扩增16S rRNA基因序列进行DGGE分析,并对DGGE凝胶上7条优势条带进行回收克隆测序。【结果】共获得9条序列（5条为古菌序列、4条为非古菌序列）,5条古菌序列中有3条与甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）的同源性高达99%、1条与甲烷短杆菌的同源性达98%、1条与广古菌门（Euryarchaeota）热原体目（Thermoplasmatales）的同源性达98%;而4条非古菌序列分别属于拟杆菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）,且彼此间同源性较小。【结论】通过PCR-DGGE技术可以较好地分析水牛瘤胃产甲烷菌的多样性。     

相似穿孔线虫伴生细菌群落多样性研究

[目的]揭示相似穿孔线虫伴生细菌群落物种丰度及其细菌多样性。[方法]通过构建细菌16S rDNA克隆文库,对阳性克隆进行ARDRA分析和构建系统发育树。[结果]依据97%序列相似性划分OTU,构建的细菌16S rDNA文库包含13个OTU,分别属于Alpha-proteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria,其中优势菌群为Betaproteobacteria,特别是Burkholderia为优势细菌。[结论]相似穿孔线虫的伴生细菌多样性较高,这些细菌可能对相似穿孔线虫具有一定的生态意义。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因并检测其在大肠杆菌中的表达。【方法】以自行分离筛选出的天然米曲霉giF-10的基因组DNA为模板,PCR高保真扩增,扩增产物连接到pMD19-T克隆载体上,并构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】序列分析表明,其长度为1 251bp,编码417个氨基酸,序列比对发现与内切葡聚糖酶基因CelB序列相似性高达100%,将此基因注册GenBank(HQ739052)。刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。【结论】克隆了米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因,并在大肠杆菌成功表达,为纤维素酶工业化生产奠定基础。     

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全长的克隆及序列分析

【目的】克隆巴什拜羊杀菌/通透性增强蛋白(BPI)的cDNA序列,为研究该蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到中性粒细胞后提取RNA。根据GenBank中牛BPI基因的cDNA序列设计兼并引物,用RT-PCR方法扩增巴什拜羊BPI基因部分序列,再根据已知的巴什拜羊BPI基因部分序列设计RACE引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,分别回收克隆的目的基因片段,再与pMD18-T载体连接,分别转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后进行拼接,获得巴什拜羊BPI基因全长cDNA序列,并对序列进行分析。【结果】克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全长1 922bp,其中开放阅读框为1 452bp,共编码483个氨基酸;BLAST分析表明,巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列与绵羊、牛、虎鲸、野猪、猕猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分别为99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53%和50%;氨基酸进化分析显示,巴什拜羊首先与绵羊聚为一类,其次与牛聚为一类,该聚类分析结果与生物学分类结果表现一致。【结论】通过RACE方法成功地克隆了1 922bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全长序列,且基因进化树聚类结果与生物学分类结果相一致。     

蓝莓根际土壤微生物群落结构及促生菌筛选

【目的】从促生微生物角度分析蓝莓根际土壤微生态结构,改良蓝莓种植土壤。【方法】利用高通量扩增子测序方法对北高丛蓝莓根际土壤微生物多样性进行分析。利用选择性培养基、比色法等实验方法分析蓝莓根际可培养细菌的促生特性。【结果】土壤样品中有10个细菌门和3个真菌门的相对丰度大于1%,13个细菌属和11个真菌属的相对丰度大于1%;Occallatibacter OTU6、Paraburkholderia OTU3以及Chujaibacter OTU945是细菌OTU相对丰度最高的序列,Pseudogymnoascus OTU1、Fusarium OTU7、Lentinus OTU2是真菌OTU相对丰度最高的序列。蓝莓根际土壤可培养细菌的促生效能分析结果表明,12株蓝莓根际可培养细菌为能够分泌生长素的促生菌,其中L7菌株产生的生长素最多;12株菌均能在解磷培养基上生长,且具有显著解磷圈,其中菌株L42的解磷能力最强;菌株L11和L17具有一定分解硅酸盐的能力;菌株拮抗实验结果表明,L17菌株与L21、L26、L37、L40及L42菌株之间不存在生长抑制作用,菌株L21与菌株L26、L40之间存在强...     

春性甘蓝型油菜FCA同源基因可变剪接体的克隆及表达研究

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,并分析该基因的表达模式。【方法】根据拟南芥和芸薹属植物FCA基因的DNA序列和cDNA序列设计引物,用PCR和RT-PCR技术克隆特早熟春性甘蓝型油菜"86号"的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,对克隆基因及编码蛋白序列进行生物信息学分析,构建系统进化树,并用qRT-PCR技术检测sBnFCA基因在不同发育时期根、茎、叶、茎尖中的表达量。【结果】克隆出了sBnFCA基因的全长序列(8 827bp),得到了sBnFCA-γ可变剪接体及一个新的可变剪接体(sBnFCA-5),新的可变剪接体在GenBank中的登录号为KJ701579.1。sBnFCA-5剪接体的CDS全长1 986bp,编码662个氨基酸残基,其推导的氨基酸序列具有2个保守的RRM结构域和1个WW结构域。生物信息学分析显示,sBnFCA-5与已报道甘蓝型油菜BnFCA-γ(AF414188.1)的相似性达99%,与拟南芥FCA-γ的相似性达87%。sBnFCA-5比sBnFCA-γ少了172个碱基序列,是一个跨外显子剪接体。sBnFCA蛋白相对分子质量和理论等电点分别为72.5ku和9.2。基因表达模式分析显示,sBnFCA-γ和sBnFCA-5在苗期、蕾期、花期的根、茎、叶和茎尖组织中都有表达,sBnFCA-γ在蕾期茎尖和花期叶片中表达量较高,sBnFCA-5在蕾期茎尖和花期叶片中表达量极高。【结论】克隆的sBnFCA-5为甘蓝型油菜sBnFCA基因的一个新的可变剪接体,该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能有着重要的调节作用。     

辣椒花药胚状体发育相关基因的克隆与分析

【目的】从辣椒花药中克隆与胚状体发育相关的基因,并对其进行序列分析。【方法】以LTP基因、GST基因同源序列设计简并引物,采用RT-PCR方法对辣椒小孢子胚状体发育相关基因进行克隆,测序后对其进行分析。【结果】获得2个可能与辣椒花药胚状体发育相关的基因片段PELTP(GenBank登录号为:EF583618)和PEGST(GenBank登录号为:EF583619),其长度分别约为750 bp和1 000 bp。序列分析表明,PELTP基因与辣椒LTP基因同源性为98%,PEGST基因与辣椒GST基因的同源性为99%。【结论】PELTP和PEGST基因可能在辣椒小孢子胚状体发育早期起着重要作用。     

福寿螺多功能纤维素酶基因egx的克隆及其体外功能性表达

 【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。【方法】通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织总RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx序列,连接克隆载体pMD18-T,再通过Eco RⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体pET-32a（+）及pcDNA3.1（+）连接,构建原核、真核表达载体,并在E.coli BL-21（DE3）和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。【结果】RT-PCR扩增得到1 326 bp的序列,包括1 185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因cDNA序列相似性为99%,氨基酸序列相似性为100%。原核细胞表达产物经包涵体复性后,对羧甲基纤维素钠、2-羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、微晶纤维素、木聚糖的水解活性分别为：24.78、15.67、18.42、600.91和175.43 U•mg-1;而在PK15细胞中重组酶对以上5种底物的活性分别为：0.84、0.78、1.01、14.62和4.23 U•mL-1。【结论】克隆出了福寿螺多功能纤维素酶基因,并能在大肠杆菌和哺乳动物细胞中成功地表达。     

滇池表层沉积物中微塑料的空间分布及来源分析

【目的】研究滇池表层沉积物中微塑料污染的空间分布及其来源。【方法】于2019年4月和2021年9月在滇池14个采样点利用彼得森抓斗采集表层沉积物,采用密度浮选法分离表层沉积物中的微塑料,利用体式显微镜和拉曼光谱仪器分别对微塑料进行镜检与聚合物鉴定,最后对微塑料丰度与水深的关系进行相关性分析。【结果】滇池表层沉积物中微塑料的丰度为344.6～1 171.8个/kg (干质量)之间,平均丰度为(609.6±206.1)个/kg,处于高污染水平。纤维状微塑料的数量占比高达83.49%,碎片状、颗粒状和薄膜状微塑料的数量占比均约为5%;蓝色和透明色微塑料的数量占比较大,分别为46.43%和34.92%,红色、黑色和绿色微塑料的数量占比依次减少;粒径<1 mm、1～3 mm和>3～5 mm的微塑料数量占比分别为69.74%、27.62%和2.64%;微塑料的主要聚合物为聚对苯二甲酸乙二醇酯、染色微塑料和聚丙烯,占比分别为38.12%、36.77%和12.56%。【结论】滇池表层沉积物中的微塑料主要分布在北部湖心及南部出水口区域,整体呈现“南多北少”的分布格局。根据微塑料的理化特征及周...     

牦牛SPAG11基因克隆与生物信息学分析

【目的】克隆牦牛(Bos grunniens)精子相关抗原11(Sperm-Associated Antigen 11,SPAG11)基因,并了解其分子结构特征,为进一步研究牦牛SPAG11生物学功能奠定基础。【方法】从牦牛睾丸中提取总RNA,RTPCR扩增并克隆SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E基因,测序后进行生物信息学分析。【结果】克隆出牦牛SPAG11基因3个亚型:SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E,序列大小分别是351,408和261bp,分别编码117,129和80个氨基酸,其中SPAG11 D和SPAG11E序列包含1个完整开放阅读框(ORF),SPAG11C序列包含部分ORF。牦牛SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E核苷酸序列与黄牛(Bos taurus)相应序列相似性最高,而与黄牛β-防御素1相似性较低(50%)。3个蛋白亚型均具有β-防御素家族基本特性,生物信息学分析显示其均含有磷酸化位点。【结论】成功克隆牦牛SPAG11C、SPAG11 D和SPAG11E基因,明确了其编码蛋白的分子结构特征。