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相似文献
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1.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
采用RT-PCR方法扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒临床分离株(HBKM2)的ORF5全基因,并进行了测序分析,根据0RF5的结构特点,进一步扩增了截去N端信号肽序列的ORF5(nsORF5),并将其克隆到pGEX-KG原核表达载体,构建了重组质粒pKG-ns5,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的nsORF5基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-nsGP5分子量约为43kD,并具有反应活性,这为进一步研究PRRSV GP5蛋白的功能及新型疫苗、血清学诊断方法的研制奠定了基础.  相似文献   

2.
[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白(N)基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T.1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31(DE3)感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39.866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10%的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。  相似文献   

3.
为了给河北地区预防和控制猪繁殖与呼吸综合征提供理论数据。应用RT-PCR方法特异性扩增HB-3(cz)株的ORF7(N)基因片段,将扩增片段克隆入pMD-T载体后测序,应用DNAstar分析软件对序列进行分析,并与GenBank中发表的PRRSV毒株序列进行比较。结果显示:HB-3(cz)株与高热病毒株JXA1、HUB2等及传统河北分离株HB-1(sh)氨基酸同源性高达97.6%,属美洲型毒株。将目的片段克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,重组质粒pGEX-N转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达,经Western-blot-ting分析表明:表达的融合蛋白分子量约为39.5 kDa,能与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,为PRRSV血清学诊断方法的建立奠定了基础。  相似文献   

4.
H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达   总被引:6,自引:0,他引:6       下载免费PDF全文
为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.  相似文献   

5.
对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM—N双酶切.回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中,构建了重组质粒pET—N;将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。  相似文献   

6.
[目的]克隆和表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因。[方法]采用RT-PCR方法对PEDV FD株的N基因进行扩增,将扩增产物连接pET-28B载体,阳性质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达目的蛋白。[结果]PEDV FD株N基因序列全长为1 326个核苷酸,编码441个氨基酸;重组N蛋白为可溶性表达,大小约58 ku;Western blot检测结果表明,重组N蛋白与PEDV抗体阳性血清发生特异性反应。[结论]该试验制备的PEDV重组N蛋白具有较好的免疫原性,可用于PEDV诊断方法的开发及相关研究。  相似文献   

7.
[目的]对山西省马铃薯Y病毒cp基因进行克隆与序列特征分析。[方法]依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了一对引物PVYP1和PVYP2,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,对RT-PCR扩增得到的基因片段进行序列测定。[结果]该DNA片段1~798bp为马铃薯Y病毒印基因,799~1064bp为3’非编码区序列,可编码265个氨基酸。将RT—PCR产物与载体连接后转入大肠杆菌提取阳性克隆的质粒DNA,酶切后琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,重组质粒已转入大肠杆菌。BLAST软件分析表明,山西省马铃薯Y病毒分离物CP氨基酸序列与已公布的PVY CP氨基酸序列相似性最高可达100%,说明所得DNA片段确为PVY cp基因片段。[结论]该研究为对山西省马铃薯Y病毒的防治提供理论依据。  相似文献   

8.
克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因,并进行序列分析及原核表达。根据GenBank公布的PRRSV ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株糖基化囊膜蛋白基因ORF5,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。再设计另外1对引物扩增ORF5缺失编码N端31个氨基酸残基的基因片段,将截短的ORF5基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行原核表达。结果扩增到603 bp的PRRSV全长ORF5基因,序列分析表明,分离株与北美型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%。因此推测陕西分离株属于北美型。SDS-PAGE可检测到大小约为38 ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。West-ern-blot分析表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。  相似文献   

9.
[目的]构建传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。  相似文献   

10.
[目的]构建传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。  相似文献   

11.
根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。  相似文献   

12.
[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。  相似文献   

13.
根据猪瘟病毒(CSFV)的E2基因保守序列、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因及部分ORF6和3-UTR基因序列和猪乙型脑炎病毒(JEV)的E基因保守序列,设计了3对引物,扩增大小分别为288 bp、430 bp和1 015 bp目的片段.以纯培养病毒抽提RNA,制备cDNA模板,利用3对引物,通过条件的优化,建立了同时检测这3种病毒的多重RT-PCR.CSFV、PRRSV和JEV的RNA最小检出量分别为0.270 ng、0.049 ng、0.067 ng,其它的RNA病毒如TGEV以及DNA病毒如PPV、PrV、PCV-2检测结果为阴性.以β-actin为对照,利用本方法检测了174份临床样品(血清、肺脏和胎儿),其结果为:PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为30.4%、4.6%和1.7%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为1.7%.同时对临床样品中CSFV、JEV和PRRSV阳性PCR产物进行测序分析,发现CSFV、PRRSV和JEV的PCR产物序列和NCBI数据库中目标基因的同源性分别为92%、90%和89%,这证实了多重PCR的阳性结果为上述3种病毒.结果证明,所建立的多重RT-PCR可用于临床检测.  相似文献   

14.
以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。  相似文献   

15.
[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症发病原因,流行趋势,为预防和控制猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)提供理论依据。[方法]根据GenBank上的PRRSV的ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT-PCR技术扩增了7株流行株中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的系统进化树。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%~98.8%,89.9%~95.2%,85.6%~98.7%;与LV的同源性为54.7%~56.9%。氨基酸序列分析表明,这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88.1%~96.8%,88.1%~94.5%,86.1%~96.5%;与LV的同源性为54.7%~56.2%。[结论]流行株在ORF5基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF5基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。  相似文献   

16.
PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化   总被引:2,自引:2,他引:0  
从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T栽体.基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为...  相似文献   

17.
根据GenBank公布的PRRSVORF3基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株ORF3基因,将其克隆入pGEM-T载体中,测序并进行序列分析。再将ORF3基因亚克隆入pET-32a中,构建原核表达载体。结果扩增到765 bp的PRRSV全长ORF3基因,序列分析结果表明,分离株与SY0608亲缘关系较近,而与CH-2、HB-2关系较远。重组原核表达质粒经酶切鉴定正确后命名为pET-GP3,为进一步研究GP3蛋白的原核表达、免疫特性、结构与功能奠定了基础。  相似文献   

18.
1材料与方法1.1表达菌及试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)6P-1-GP5表达质粒由该实验室保存。Novagen蛋白纯化试剂盒、硝酸纤维素膜(NC膜)均购自华美公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司;辣根酶标记兔抗猪IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他常规试剂均由国内生产。试验用豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供,体重400-500g,共8只。  相似文献   

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