FSTL1基因促进猪前体脂肪细胞分化成脂的机制

【目的】构建猪FSTL1基因过表达载体和RNAi载体,探究FSTL1基因对猪前体脂肪细胞分化成脂的作用及机制。【方法】通过构建FSTL1基因过表达载体和RNAi载体,在猪前体脂肪细胞中过表达、干扰FSTL1基因并诱导其分化,测定细胞中甘油三酯含量以及脂肪细胞分化相关调节基因的m RNA表达量。【结果】成功克隆得到猪FSTL1基因c DNA序列,其开放阅读框全长924 bp,并将序列提交到GenBank,登录号为KF021281。成功构建猪FSTL1基因的过表达载体pcDNA3.1-FSTL1和RNAi载体pSilencer4.1-491以及pSilencer4.1-530。过表达FSTL1基因促进了猪前体脂肪细胞中甘油三酯生成,干扰FSTL1基因抑制了猪前体脂肪细胞中甘油三酯的生成。FSTL1在猪前体脂肪细胞中使PPARγ2和AP2基因表达分别上调了73%和113%,使LPL、 Adiponectin和FASN等基因表达分别下调了44%、79%和16%。【结论】FSTL1基因通过上调PPARγ2和AP2基因,下调LPL、Adiponectin及FASN基因的表达,促进猪前体脂肪细胞的分化,提高猪前体脂肪细胞中甘油三酯的含量。     

黄羽肉鸡FAT/CD36 cDNA的分子克隆及其发育性表达

 【目的】克隆鸡FAT/CD36 cDNA的全长序列并探讨FAT/CD36 mRNA的发育性表达。【方法】采用cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆鸡FAT/CD36 cDNA的全长序列。选用22、29、42和56日龄的黄羽肉鸡公鸡和母鸡各10羽，分离皮下脂肪和腹脂并称重，同时测定22和56日龄时胸肌和腿肌的脂肪含量。分别采集胸肌、腿肌、皮下脂肪和腹脂样品，采用实时荧光定量RT-PCR方法检测了FAT/CD36 mRNA的表达。【结果】鸡FAT/CD36 cDNA的序列全长为2 243 bp（GenBank：DQ323177），其中包括1 416 bp开放阅读框（ORF）。黄羽公鸡皮下脂肪和腹脂的沉积量随日龄的增加逐渐升高，腿肌和腹脂FAT/CD36 mRNA 的表达水平也逐渐升高，其中腹脂的表达水平在所检测的各组织中最高；母鸡FAT/CD36 mRNA 的表达水平在生长早期（22和29日龄）较高，但在后期（42和56日龄）反而有下降的趋势。【结论】本研究成功地克隆了鸡FAT/CD36 cDNA的全长序列，黄羽肉鸡肌肉和脂肪组织FAT/CD36的表达存在性别差异。     

西门塔尔牛肌内和皮下脂肪miRNA表达谱及miR-27b靶基因分析

【目的】通过分析西门塔尔牛肌内脂肪和皮下脂肪差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA-27b进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在动物肌内脂肪生长、发育过程中的作用及其调控机制。【方法】利用miRNA微阵列芯片技术对肌内脂肪和皮下脂肪miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;qRT-PCR方法验证4个在肌内脂肪显著高表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-27b（对肌内脂肪沉积可能起重要调节作用）的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。【结果】miRNA芯片分析发现肌内脂肪和皮下脂肪共有88个差异表达极显著miRNA（P＜0.01）。候选的4个在肌内脂肪高表达miRNAs（miR-140、miR-145、miR-143、miR-27b）的qRT-PCR检测结果与芯片分析结果具有很好的一致性。KEGG富集显示,目标miR-27b的预测靶基因在MAPK、Wnt、Hedgehog、TGF-beta、GnRH等信号通路中显著富集,其中在MAPK信号通路中富集度最高。【结论】牛肌内脂肪和皮下脂肪组织中确实存在一些差异表达的miRNAs,某些重要的在差异高表达miRNA（如miR-27b）可能以独特的通路（如MAPK信号）来调节牛肌内脂肪的形成过程。     

高效液相色谱法检测猪组织中硝基咪唑类药物残留

 【目的】 建立猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中羟基地美硝唑、洛硝唑、甲硝唑、替硝唑、地美硝唑和奥硝唑残留的高效液相色谱（HPLC）测定法。【方法】样品中硝基咪唑类药物用二氯甲烷萃取，盐酸反萃取。盐酸溶液用K2HPO4碱化，再用二氯甲烷反萃取，萃取液于40℃水浴中旋转真空蒸干。残余物用流动相0.5 ml溶解，进样分析。色谱柱为Hypersil ODS2，紫外检测器，检测波长320 nm。以甲醇﹕水（14﹕86，V﹕V）为流动相，进样量20μl。【结果】6种药物标准液浓度在0.005～2.0μg•ml-1时，与响应值呈良好线性关系，相关系数均＞0.999。羟基地美硝唑、洛硝唑和甲硝唑在肌肉和脂肪组织中检测限为0.5μg•kg-1，在肝脏和肾脏中为1.0μg•kg-1； 替硝唑、地美硝唑和奥硝唑在肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中均为1.0μg•kg-1。空白样品添加药物浓度为0.5～4.0μg•kg-1时，6种药物的回收率为60％～83％，日间变异系数均＜15％。【结论】该方法能灵敏、准确的检测猪组织中硝基咪唑类药物。     

杜长大商品猪肌内脂肪含量的全基因组关联分析

【目的】通过全基因组关联分析,定位影响杜长大商品猪肌内脂肪含量的相关SNP位点及其重要候选基因,为利用分子生物学方法改良猪肌内脂肪含量提供科学依据。【方法】选取981头杜长大商品猪,包括阉割公猪447头、母猪534头,所有试验猪均在统一条件下饲养至150日龄后进行屠宰测定,屠宰后利用索氏浸提法对肌内脂肪含量进行测定。利用GeneSeek GGP 50K芯片进行基因分型,使用rMVP软件包的FarmCPU模型对肌内脂肪含量性状进行全基因组关联分析。【结果】杜长大商品猪平均肌内脂肪含量达2.27%,其变异系数为34.24%,基因组遗传力(h2)为0.39,属于中等遗传力性状,表明该性状具有较大的遗传改良空间。经质控后,剩余30600个SNPs位点用于全基因组关联分析,共发现有8个潜在SNPs位点与肌内脂肪含量相关,分别分布在2、3、5、11、12、13和14号染色体上。利用Gene Ontology数据库对可能影响肌内脂肪含量的候选基因进行GO功能注释分析,发现这些候选基因参与的代谢通路包括肌肉发育代谢过程、器官生长代谢、基因表达调控及RNA转录等生物学代谢过程,但主要以肌肉生长发育代谢通路为主,表明肌内脂肪含量与肌肉生长发育之间存在紧密联系。【结论】利用高密度芯片进行全基因组关联分析,发现有8个SNPs位点与肌内脂肪含量相关;根据基因生物学功能及相关研究文献,C2orf74、HS6ST3和ROBO2基因主要参与细胞增殖分化及脂肪代谢等生物学过程,可作为影响肌内脂肪含量的重要候选基因。     

绵羊肌内脂肪前体细胞的体外培养及分选

为建立绵羊肌内脂肪前体细胞的体外培养模型,选用组织块法培养绵羊肌内脂肪前体细胞,制备用荧光染料PE(Phycoerythrin)标记的兔抗绵羊Pref-1蛋白的多克隆抗体,通过流式细胞术分离纯化脂肪前体细胞,对纯化后的细胞进行诱导分化以及油红O染色鉴定。结果表明:利用流式细胞仪能分选纯化出被标记的肌内脂肪前体细胞且分选率近30%;纯化后得到的细胞是功能活跃的脂肪前体细胞。研究表明,用绵羊羔羊肌肉组织采用组织块培养法可以建立绵羊肌内脂肪前体细胞培养模型,抗绵羊Pref-1蛋白多克隆抗体可以作为纯化脂肪前体细胞的工具。     

绵羊肌肉LPL基因表达的发育性变化及其对肌内脂肪含量的影响

 【目的】研究绵羊肌肉中脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）基因mRNA的发育性变化规律及其对肌内脂肪沉积的影响。【方法】选取2、30、60、90和120日龄的雄性哈萨克羊和新疆细毛羊各6只（120日龄只有新疆细毛羊），屠宰后取背最长肌检测肌内脂肪含量，用荧光实时定量PCR法检测肌肉LPL基因mRNA表达水平，分析在不同时期的变化及其与肌内脂肪含量的关系。【结果】随着日龄的增加，雄性哈萨克羊的IMF（Intramuscular Fat）含量持续上升，各生长时期差异显著（P＜0.05），而新疆细毛羊的IMF含量在各生长时期无显著差异（P＞0.05），雄性哈萨克羊的IMF含量30～90 d期间极显著高于新疆细毛羊（P＜0.01）；雄性哈萨克羊肌肉LPL基因的表达量在2日龄时最高，60日龄时降到最低，然后逐渐上升，2日龄时LPL表达量极显著高于其它日龄（P＜0.01）。新疆细毛羊的表达量在2日龄时较低，30日龄时升到最高，随后下降，到90日龄时降到最低，然后又逐渐上升；30日龄表达量与2、90、120日龄差异极显著（P＜0.01），与60日龄差异显著（P＜0.05）；60日龄表达量与2、90、120日龄差异显著（P＜0.05）；哈萨克羊LPL基因2～60日龄的表达量与IMF含量呈负相关，相关系数为-0.625（P＜0.05）；新疆细毛羊IMF含量与LPL基因表达量无显著相关性。【结论】新疆细毛羊和哈萨克羊背最长肌肌内脂肪沉积的发育性变化不同，在生长发育早期，哈萨克羊随日龄的增加其IMF上升，新疆细毛羊在各时期保持一个稳定的水平；LPL基因在哈萨克羊生长早期对其肌内脂肪的沉积可能有负调控作用，而对新疆细毛羊无明显作用。     

siRNA沉默NCOA2基因对猪肌内前体脂肪细胞分化的影响

[目的]本文旨在研究核受体共激活蛋白2(nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)对猪肌内前体脂肪细胞分化能力的影响。[方法]用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测NCOA2在猪肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达变化;通过NCOA2小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制内源NCOA2的表达,并用油红O染色检测沉默NCOA2对肌内前体脂肪细胞分化能力的影响,通过qRT-PCR检测沉默NCOA2对脂肪分化关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)、脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)和脂联素(adiponectin,ADIPOQ)表达的影响。[结果]NCOA2在肌内前体脂肪细胞分化第4天表达量显著升高(P0.05);降低NCOA2表达可显著抑制肌内前体脂肪细胞分化(P0.05),且PPARγ、FABP4、LPL和ADIPOQ基因的表达也受到显著抑制(P0.05)。[结论]体外siRNA沉默NCOA2基因可抑制猪肌内前体脂肪的分化,这可能与PPARγ、FABP4、LPL、ADIPOQ等基因的低表达有关。     

阿莫西林在猪血清和组织液中对金黄色葡萄球菌的半体内药动-药效同步模型的研究#br#

 【目的】为合理应用阿莫西林治疗猪金黄色葡萄球菌感染。【方法】采用了体内药动和体外药效联合的方法研究了阿莫西林在血清和组织笼液中抗金黄色葡萄球菌的活性。【结果】体外测定,阿莫西林在血清和组织笼液中对猪金黄色葡萄球菌的MIC均在0.2 µg•mL-1＜MIC＜0.4 µg•mL-1的范围之内。如果在血清和组织液中添加更多的细菌,则需要高于MIC药物浓度才能能持续抑制细菌的生长。猪按10 mg•kg-1的剂量肌内注射阿莫西林后,在血清中,半效浓度（EC50）为143.63±54.35,即血清药物浓度为2.39 μg•mL-1时可产生50%最大效应。在组织液中,半效浓度（EC50）为29.61±5.07,即组织液药物浓度为0.49 μg•mL-1时可产生50%最大效应。【结论】临床上选择阿莫西林治疗猪金黄色葡萄球菌感染时,用药的剂量和间隔应根据实际情况确定,当治疗猪金黄色葡萄球菌轻度感染时,建议给药方案可设定为10 mg•kg-1体重的剂量进行颈部肌内注射,给药间隔为2次/日。当治疗重度感染时由于体内MIC的升高,体内药物维持抗菌时间减少,必须增加给药次数,可设为3次/日,必要时可增加为4次/日。     

猪皮下与内脏脂肪组织mRNA转录组的构建与差异分析

【目的】研究猪皮下脂肪和内脏脂肪的表型和代谢差异,找出差异转录本。【方法】选取长白母猪的皮下脂肪(背部皮下脂肪)和内脏脂肪(大网膜脂肪和肠系膜脂肪)进行表型测定及高通量转录组测序(RNA-Seq)。【结果】①背部皮下脂肪体积最大,大网膜次之,肠系膜的脂肪体积最小;与皮下脂肪相比,内脏脂肪中饱和脂肪酸含量更高(P<0.01)而不饱和脂肪酸的含量相对较低(P<0.05);②转录组测序共获得30 532 913～33 479 707个唯一比对到基因组的读段(reads),鉴定了22 015个转录本,覆盖猪已注解转录本的80.2%,同时还发现4 583～4 765个新的转录本、936～1 029个可变剪切、16 559个单核苷酸多态位点(SNPs)和1 481个插入/缺失位点(INDELs)。③皮下脂肪和内脏脂肪间差异表达的基因共有183个,基因注释(GO)和代谢通路(Pathway)分析发现它们在不饱和脂肪酸合成、羧酸代谢和炎症反应过程中有重要作用。【结论】提供了猪皮下脂肪和内脏脂肪的完善转录组信息,获得了影响脂肪酸代谢的潜在候选基因,为进一步揭示皮下脂肪和内脏脂肪的功能特征与差异提供了数据基础。     

猪脂肪前体细胞的原代培养及诱导分化

以2日龄仔猪皮下脂肪组织为材料,采用胶原酶消化法分离培养出细胞成分均一、增殖旺盛的原代脂肪前体细胞。对所获细胞采用含50 nmol/L胰岛素+100 nmol/L地塞米松+0.25 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+100nmol/L罗格列酮的分化培养液进行诱导分化培养,少量细胞第2 d开始出现脂滴,大多细胞第3 d出现脂滴,分化率达95%以上,第4~7 d小脂滴逐步融合为大脂滴。在脂滴出现及汇聚快慢上本实验所采用诱导方法明显快于其他诱导方式。     

不同冻存保护剂对绵羊前体脂肪细胞冻存效果的影响

【目的】探讨绵羊前体脂肪细胞冷冻保存的最佳冻存保护剂种类和浓度。【方法】在含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中分别添加不同浓度的DMSO、EG、PG、G和PVP作为冻存液,对原代培养的绵羊前体脂肪细胞进行冷冻保存后,检测复苏细胞存活率、细胞增殖能力、细胞中脂肪沉积量,测量GPDH活性,并用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平,最后对复苏细胞进行染色体核型分析。【结果】各种冻存保护液中,10% DMSO和5% DMSO+5% PVP组细胞存活率最高,与对照组相比差异不显著（P＞0.05）,其它各试验组复苏细胞存活率均显著低于对照组（P＜0.05）;各试验组中10% DMSO组细胞增殖能力最强,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;细胞复苏后培养6 d,各试验组脂肪沉积量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）,而第11天时,10 % DMSO组脂肪沉积量显著高于其它试验组（P＜0.05）,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;各试验组GPDH活性和LPL、PPARγ mRNA 的表达量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）;染色体核型分析发现,复苏细胞二倍体细胞占主体,与原代细胞没有显著差异（P＞0.05）。【结论】含20% FBS的DMEM/F12培养液中添加10% DMSO或10%PVP、5% DMSO+5% PVP均能有效保存绵羊前体脂肪细胞,但以10% DMSO最佳。     

瘦素对鸡原代前体脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】探究不同浓度瘦素对鸡原代前体脂肪细胞增殖分化的影响。【方法】以12日龄科宝肉鸡腹部脂肪为材料进行原代前体脂肪细胞培养,细胞铺板24 h后,试验组细胞以添加了0、50、200、800 ng/m L瘦素的培养基进行培养,每隔24 h换一次液,至72 h。采用CCK8法绘制对照组和瘦素处理组细胞的生长曲线,油红O提取比色法测定脂肪含量变化,Real-time PCR方法检测前体脂肪细胞分化过程中关键基因PPARγ和SREBP1c的表达。【结果】CCK8法与油红O提取比色法表明,0~800 ng/m L瘦素对鸡前体脂肪细胞的增殖分化无显著影响(P0.05),Real-time PCR结果表明不同浓度的瘦素处理对前体脂肪细胞内脂肪分化关键基因PPARγ和SREBP1c的表达无显著影响(P0.05)。【结论】本试验证明0~800 ng/m L瘦素对鸡前脂肪细胞的增殖和分化无影响。     

烟酰胺削弱罗格列酮诱导猪前体脂肪细胞凋亡的作用与分子机制

【目的】探讨烟酰胺（nicotinamide, NIC）和罗格列酮（rosiglitazone, RSG）对猪前体脂肪细胞凋亡的作用及分子机制,寻找通过凋亡方式调控脂肪细胞数目进而控制生脂的新途径。【方法】分别用含有 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol•L-1 RSG的培养基处理猪前体脂肪细胞,在处理后的48 h,对不同处理组细胞进行Hoechst33258和Annexin-V-FITC/PI染色以观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白,用Western blotting方法检测细胞凋亡关键基因的蛋白表达水平;基于RSG促凋亡的浓度梯度结果,选用1.0 mmol•L-1 RSG分别与含0、0.1、0.2和0.3 mmol•L-1 NIC的培养基共处理细胞,在处理后的48 h,染色并观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡情况;并收集细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白,检测细胞凋亡关键基因的蛋白水平。【结果】 RSG以浓度依赖方式诱导猪前体脂肪细胞凋亡,减少了细胞数目;Bcl-2和cleaved Caspase-3凋亡关键蛋白水平随RSG浓度增加而上升,Bax则下降;0.1（P＜0.05）、0.2（P＜0.01）和0.3 mmol•L-1 （P＜0.01）NIC显著削弱1 mmol•L-1 RSG诱导猪前体脂肪细胞凋亡,Bcl-2和cleaved Caspase-3水平显著被下调（P＜0.05）,Bax则被上调（P＜0.05）;0.3 mmol•L-1 NIC明显有助于1 mmol•L-1 RSG处理的猪前体脂肪细胞中的Sirt1由细胞质向核转移,且抑制核中cleaved Caspase-3水平。【结论】NIC通过促进Sirt1由细胞质到核的转位以及下调核中cleaved Caspase-3水平削弱RSG诱导的猪前体脂肪细胞凋亡。     

LncFAM200B对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响

【目的】拟通过腺病毒介导的超表达及siRNA干扰试验,分析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的影响,为解析lncFAM200B对牦牛肌内脂肪细胞脂质沉积的调控机制奠定基础。【方法】采集牦牛背最长肌组织,采用酶消化法和差速贴壁法分离牦牛肌内前体脂肪细胞;构建包装lncFAM200B超表达腺病毒,设计合成其siRNA干扰序列;通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析lncFAM200B超表达与干扰后脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1、PTEN的表达水平;采用油红O染色、甘油三酯（TAG）测定、CCK-8检测等方法检测细胞内脂滴沉积情况、甘油三酯含量变化及细胞增殖情况。【结果】从牦牛背最长肌成功分离获得肌内前体脂肪细胞;lncFAM200B超表达后,脂肪分化标志基因C/EBPα、AP2表达量显著升高（P<0.05）,随着诱导分化时间的增加,lncFAM200B潜在靶基因SIRT1表达量呈先降低后升高的趋势,PTEN表达量呈现先增高后降低趋势;细胞脂滴沉积显著增加（P<0.05）,且胞内形成较大脂滴;超表达4 d后,细胞内甘油三酯含量显著增加（P<0.05）。干扰lncFAM200B可显著降低脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、AP2的表达水平（P<0.05）,降低细胞脂肪沉积,且诱导分化第6天细胞内甘油三酯含量显著降低（P<0.05）;干扰lncFAM200B后其潜在靶基因SIRT1呈现先升高后降低的表达趋势,PTEN则相反。CCK-8增殖实验表明,lncFAM200B超表达72 h后,细胞增殖效率显著降低（P<0.05）,而干扰lncFAM200B后72 h后细胞增殖效率显著增强（P<0.05）。【结论】lncFAM200B可能通过影响脂肪分化标志基因C/EBPα和AP2,脂肪合成相关基因SIRT1和PTEN的表达从而影响牦牛肌内脂肪沉积,但其具体机制还需要进一步研究。     

绵羊肌内前体脂肪细胞CNR1和FABP4基因表达研究

为研究绵羊脂肪细胞增殖分化过程中参与动物能量代谢调控的大麻素受体1（cannabinoid receptor 1）基因CNR1和调控脂肪沉积的脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4）基因FABP4的表达规律和差异,采集一只3日龄湖羊羔羊背最长肌组织,背肌组织经Ⅱ型胶原酶消化后分离观察原代前体脂肪细胞;开展前体脂肪细胞培养并绘制生长曲线;应用胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导前体脂肪细胞后,采用油红O染色观察成熟脂肪细胞形态;收集不同分化时间点细胞,应用实时荧光定量PCR方法测定CNR1和FABP4基因表达量。结果表明,羔羊背最长肌组织成功分离出了前体脂肪细胞,贴壁细胞呈梭形;诱导前体脂肪细胞经油红O染色后观察到脂滴形成,具有脂肪细胞特征;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化早期均较低,但在诱导分化中后期表达量逐步升高;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化后的第2、第4和第8天均差异不显著,但FABP4基因在第12天的表达量显著高于CNR1基因。上述结果为进一步探究绵羊CNR1和FABP4基因调控关系及利用两基因改良绵羊肉品性状提供了参考数据。     

甘薯sporamin蛋白对3T3-L1前脂肪细胞分化和增殖的影响

 【目的】探讨甘薯sporamin蛋白对3T3-L1前脂肪细胞分化与增殖的影响,为开发预防和治疗肥胖、糖尿病的保健食品提供理论依据。【方法】采用硫酸铵沉淀、离子交换、凝胶过滤层析的方法对‘55-2’甘薯中的sporamin蛋白进行分离纯化。然后,以黄连素为阳性对照,用不同浓度sporamin（0、0.025、0.125、0.250、0.500、1.000 mg?ml-1）处理3T3-L1前脂肪细胞。采用油红O染色和比色定量检测细胞内脂肪生成及细胞分化程度,以MTT法检测细胞的增殖。【结果】经离子交换、凝胶层析可纯化出高纯度的sporamin蛋白A和B（相对分子量分别为31 kD和22 kD）。与空白相比,用不同浓度的sporamin蛋白处理后,3T3-L1前脂肪细胞的分化受到明显抑制。当sporamin蛋白浓度增至0.500 mg?ml-1时,脂滴生成量明显减少,洗脱液吸光度值降至最低为0.35（P＜0.05）。此外,高浓度的sporamin蛋白能有效地抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,且随着处理时间延长抑制效果更加明显(P＜0.05).【结论】甘薯sporamin蛋白能抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化和增殖,具有潜在的减肥作用。     

MiR-433-3p靶向调节绵羊BCKDHB表达

【目的】通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制。【方法】利用Target Scan、miRanda和DIANA-micro T 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs。为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3′-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-GLO,成功构建BCKDHB 3′-UTR的双荧光素酶报告载体。从公司购买miR-433-3p的过表达载体mimics和阴性对照载体NC,设置miR-433-3p过表达、阴性对照、空白对照3个组,分别将2组载体和双荧光素酶报告载体利用lipofectamineTM3000转染试剂共转染至miR-433-3p过表达、阴性对照组的HEK-293T细胞中,空白对照组中的HEK-293T细胞正常培养,之后分别检测3组细胞中的荧光活性,得到萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参计算萤火虫荧光素酶的相对活性。便于了解miR-433-3p和BCKDHB在绵羊前体脂肪细胞中的调控机制,对采取的绵羊尾部前体脂肪细胞进行离体培养。用过表达miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB的调控,提取过表达miR-433-3p前后细胞的总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR检测过表达miR-433-3p前后的miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量、以及利用Western blotting技术检测BCKDHB在过表达前后的蛋白水平。为了解绵羊前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p表达量的变化,用RT-qPCR检测前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p的时序表达。为增加结果的可信度,还对分化过程中不同时段的细胞进行了照片采集和油红O染色。【结果】miR-433-3p在BCKDHB3′-UTR的第8—28个碱基处存在理论上的结合位点。通过比较过表达组,阴性对照组,对照组的相对荧光活性发现过表达miR-433-3p后,BCKDHB 3′-UTR重组双荧光载体的相对荧光活性降低(P0.01),说明miR-433-3p可以与BCKDHB 3′-UTR特异性结合,验证了预测结果的准确性。在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-433-3p后,通过比较过表达组和阴性对照组BCKDHB的m RNA和蛋白的相对表达量,发现过表达组BCKDHB m RNA和蛋白的相对表达量低于阴性对照组(P0.05),说明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用。在诱导绵羊前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,从采集到的图片和油红O染色的结果发现此过程中脂滴聚积得越来越多,油红O染色验证了脂滴的聚集。另外,在分化过程中检测到miR-433-3p和BCKDHB m RNA的表达量呈现负相关关系。【结论】这些结果充分说明miR-433-3p通过与BCKDHB 3′-UTR的结合负调节该基因及其编码蛋白的表达,为进一步研究BCKDHB调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据。     

The Differentiation-and Proliferation-Inhibitory Effects of Sporamin from Sweet Potato in 3T3-L1 Preadipocytes

The aim of this study was to investigate the effect of different concentrations of sporamin on the differentiation and proliferation of 3T3-LI preadipocytes, providing the theoretical basis for the development of food to treat obesity and diabetes, The isolation and purification of sporamin from sweet potato species 55-2 were performed by ammonium sulphate precipitation in combination with ion-exchange and gel filtration chromatography. With berberine as a positive control, different concentrations ofsporamin （0.000, 0.125, 0.025, 0.250, 0.500, and 1.000 mg·mL^-1 were used to treat 3T3-L1 preadipocytes. Intracellular fat accumulation and the degree of adipogenesis were quantified using Oil Red O staining and colorimetry, Preadipocytes differentiation was measured by 3（4,5-dimethylthiazolyl-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide （MTT） spectrophotometric assay. Two sporamin proteins, which were separated into sporamin A （31 kD） and sporamin B （22 kD）, could be purified by ion-exchange and gel filtration chromatography. After being treated by different concentrations of sporamin, the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes was significantly inhibited, compared with the positive control. When the sporamin solution concentration was 0.500 mg mL-1, the accumulation of lipid droplets within the cells was significantly decreased and the optical density （OD） value of the solution from destained Oil Red O reached to 0.35, which was the lowest value （P〈 0.05）. The proliferation of 3T3-L1 preadipocytes was significantly inhibited by treating at higher sporamin concentrations. In addition, the inhibitory effect was more obvious with the prolonged treatment time （P〈 0.05）. The differentiation and proliferation of 3T3-L1 preadipocytes could be inhibited significantly by the addition of higher concentration sporamin. It was, therefore, suggested that the sporamin was potentially effective for weight loss.