苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因原核表达及其结构分析

为了研究苎麻木质素合成关键酶——咖啡酰辅酶A-甲基转移酶(CCoAOMT)基因编码的酶蛋白,了解其结构特点;采用原核表达系统——大肠杆菌表达系统pQE,对苎麻CCoAOMT cDNA编码区进行了高效表达,获得了分子量为29.4kD的苎麻CCoAOMT融合蛋白。采用SwissModel服务器模拟构建了该酶蛋白的空间结构。并利用InsightII软件包中的Docking模块构建了该酶蛋白与辅酶Sinapoyl、SAH和Ca2 相互作用的复合物的结合模型,并利用Discover模块对模拟的结构进行结构优化。可以推知所克隆的苎麻CCoAOMT cDNA编码了咖啡酰辅酶A甲基转移酶,具有O-甲基转移酶蛋白典型的催化功能,参与苎麻木质素单体前体的甲基化反应。     

龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（DLCCoAOMT）基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR 研究DLCCoAOMT 基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT 基因,GenBank 登录号为JN093023。该cDNA 全长993 bp,具有1 个744 bp 的完整开放阅读框（ORF）,编码247 个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT 编码的氨基酸序列与其它植物的 CCoAOMT 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼 DLCCoAOMT 与桦木属的CCoAOMT 蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT 基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT 基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT 基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。     

苎麻CCoAOMT基因干扰表达载体构建及对烟草的转化

根据已克隆的苎麻CCoAOMT(咖啡酰辅酶-A-氧甲基转移酶)基因cDNA序列,以其编码纤维素合成酶底物结合和催化合成结构域的 cDNA 序列为目标,采用PCR扩增方法引入克隆的酶切位点,分别将其正、反方向克隆到植物RNA干扰表达质粒PFGC5941 T-DNA上CHSA内含子两侧,构建了植物表达苎麻CCoAOMT基因的干扰重组Ti载体.将该载体转入根癌农杆菌LBA4404后,采用农杆菌介导法对木质素研究的模式烟草WS38进行了遗传转化,抗性筛选和分子检测表明,成功获得了转基因植株.转基因植株生长延缓,表明可能存在基因表达干扰现象.     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

苎麻UDPGDH基因的cDNA克隆及表达分析

 【目的】分离苎麻尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDPGDH）基因。【方法】通过简并引物RT- PCR 结合 RACE 技术和半定量RT-PCR。【结果】成功克隆苎麻Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDPGDH）基因cDNA序列，序列长1 837 bp，编码一480个氨基酸的蛋白质（GenBank No.EF178294）。半定量RT-PCR分析显示，UDPGDH在苎麻根、皮、茎和叶组织中均有表达，其表达量为茎＞皮＞叶＞根，相对表达量依次为0.7075，0.3051，0.2651，0.1490。【结论】苎麻UDPGDH与其它植物相应序列具有较高同源性，在苎麻茎中有较高的表达。     

苎麻果胶合成关键酶GalAT基因的克隆及表达

 【目的】分离和克隆苎麻果胶合成关键酶GalAT基因部分序列，了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用简并引物RT-PCR法克隆基因，用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析，并用荧光实时定量PCR法研究GalAT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了986 bp的GalAT基因部分序列（GenBank注册号：EU131377），可编码328个连续的氨基酸序列;核苷酸序列和推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase 4同源性最高，分别为77%和83%;推定的氨基酸序列与拟南芥的Galacturonosyltransferase 4可聚为一类;GalAT基因在苎麻各个组织中都有表达，其中根部的GalAT表达量占大部分。【结论】确定所获得的序列是GalAT基因的cDNA序列;GalAT表达量为根部＞叶片＞韧皮部＞或≈木质部, 在根部的表达量占优势。     

一个新的小麦非生物胁迫诱导基因的克隆及表达特性

 【目的】水分胁迫和低温是制约植物生长发育的重要限制因子，研究植物感知、传递胁迫信号，并对重要的基因进行克隆对改良作物的抗性有重要意义。本试验的目的是克隆与水分胁迫相关的基因，通过基因的功能进一步了解植物的抗旱机制，并为抗逆育种提供候选基因。【方法】试验应用噬菌体原位杂交技术从小麦旱胁迫cDNA文库中克隆了一个水分胁迫诱导基因片段W89。用5′-RACE和RT-PCR方法，获得了W89基因的全长序列。【结果】W89全长cDNA为2 392 bp，其中，编码区长1 896 bp，编码631个氨基酸。Southern杂交表明，W89是一个单拷贝基因。RT-PCR结果表明，W89受干旱、低温和ABA的诱导。氨基酸序列分析发现W89有一个DUF248保守区（pfam03141），包含一个具有SAM （Sterile Alpha Motif）结合基序的甲基转移酶区。同源性分析发现W89与一个水稻干旱诱导蛋白（BAD67956）的同源性为66%，推测W89可能是一个新的小麦干旱诱导的基因。【结论】根据甲基转移酶和SAM结合基序的功能，推测W89的SAM结合基序可能与其它蛋白或转录因子相互作用调控植物胁迫基因的表达，并且可能在干旱胁迫的早期调控信号的转导。     

茶树中奎尼酸/莽草酸-羟肉桂酰基转移酶基因的克隆及功能研究

从茶树中分离到1个绿原酸生物合成相关基因,命名为Cs HCT。该基因编码1个430个氨基酸的多肽,推测分子质量约为48.6 ku。蛋白质序列比对表明,Cs HCT含有酰基转移酶的保守域HXXXD和DFGWG,与其他物种HCT的同源性在58%~82%。系统发育分析表明,Cs HCT与咖啡中的HCT同源性最高,连同其他植物HCT形成一个独立的组群。通过大肠杆菌异源表达,纯化获得了Cs HCT蛋白,并进行了催化活性研究。结果表明,重组的Cs HCT能有效催化奎尼酸和莽草酸与香豆酰辅酶A的转酰基反应,分别生成香豆酰奎尼酸和香豆酰莽草酸。Cs HCT不能催化奎尼酸和咖啡酰辅酶A生成绿原酸。     

黄连金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶基因的克隆及序列分析

克隆黄连(Coptis chinese Franch.)金黄紫堇碱9-O-甲基转移酶(Scoulerine-9-O-methyl-transferase,SMT)基因并做序列分析.采用RT-PCR方法,以新鲜的黄连嫩叶cDNA为模板,克隆出黄连SMT基因的cDNA序列.克隆到的cDNA序列全长为1 375 bp,编码一个350个氨基酸残基组成的多肽,其核酸序列与日本黄连、唐松草的SMT基因的cDNA序列同源性分别为97%与85%.将得到的序列提交GenBank,序列号为EU980450.与日本黄连、唐松草SMT基因的氨基酸序列比对,黄连SMT具有相同功能区域,因而可以参与金黄紫堇碱的9位氧原子的甲基转移反应.黄连SMT与其它植物SMT的氨基酸酸序列的进化分析表明,它与同为毛莨科黄连属的日本黄连的同源性较近.黄连N-甲基乌药碱-3'-羟化酶基因的成功克隆为黄连植物中小檗碱的基因工程等研究打下了良好的基础.     

铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛中查尔酮合酶(CHS)基因,分析其基本生物学信息及组织表达特异性,为进一步研究CHS基因在铁皮石斛中的表达调控机理及其在铁皮石斛中的功能打下理论基础。【方法】采用铁皮石斛转录组序列与NCBI同源序列进行比对,根据保守区段设计引物克隆铁皮石斛CHS基因的cDNA全长,采用实时荧光定量PCR定量表达分析不同生长年限、不同组织部位中CHS基因的表达水平。【结果】铁皮石斛CHS基因cDNA编码区1188 bp,编码395个氨基酸,GenBank登录号KT783451,分子量为43.2 kD,理论等电点6.05。铁皮石斛GHS氨基酸序列与同属植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的CHS氨基酸序列同源性最高,达99%,与非同科植物欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis)和紫玉兰(Magnolia liliiflora)等植物的同源性在83%左右。该基因编码的蛋白质属非分泌蛋白,定位于细胞质基质中,为非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白。CHS基因在1年生铁皮石斛叶片中的表达量最高,随着植株年龄的增长,叶片中CHS基因的表达量降低,茎中的表达量升高。【结论】铁皮石斛CHS基因早期主要参与激素运输和器官形态建成,后期主要参与类黄酮物质合成。     

苎麻线粒体基因CoxⅡ和atpA与细胞质雄性不育相关性分析

 【目的】探讨线粒体CoxⅡ和atpA基因与苎麻CMS的关系。【方法】根据GenBank报道的双子叶植物线粒体CoxⅡ和atpA基因编码区高度保守序列设计简并引物，通过PCR技术从苎麻细胞质雄性不育系、保持系和恢复系(简称“三系”)mtDNA中扩增目的基因片段;采用DNA Walking策略从3′端和5′端扩增基因片段的未知侧翼序列，分离完整的线粒体CoxⅡ、atpA基因;基于全基因序列和基因表达(RT-PCR法)分析这两个基因在苎麻“三系”间的差异。【结果】分离的苎麻CoxⅡ和atpA基因片段与GenBank中一些双子叶植物同类基因的同源性分别高达95%和97%以上，获得的CoxⅡ、atpA全基因包含了完整的开放阅读框。“三系”的CoxⅡ基因在mtDNA水平、转录水平、蛋白质水平上均无明显差异。雄性不育系atpA基因在mtDNA水平、氨基酸序列和蛋白质二级结构上与保持系和恢复系存在比较明显的差异;RT-PCR分析还表明，不育系atpA基因在现蕾期和开花后期的表达量明显低于可育系。【结论】CoxⅡ基因与苎麻CMS可能无关，而不育系atpA基因的序列变异和/或异常表达可能与苎麻CMS关系密切。     

苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

大足黑山羊卵泡抑素cDNA的克隆、序列分析及组织表达

 【目的】旨在克隆大足黑山羊卵泡抑素（follistatin）的基因序列，并研究其在不同组织中的表达差异。【方法】采用RT-PCR方法从大足黑山羊卵巢组织总RNA中克隆出follistatin的cDNA序列，用相关软件进行序列分析，并利用real-time PCR技术检测follistatin基因在不同组织中的表达。【结果】序列分析表明，大足黑山羊follistatin的cDNA序列全长为1 217 bp，包括该基因完整的开放阅读框（open reading frame，ORF）1 035 bp，编码344个氨基酸。与牛的核苷酸序列比对同源性高达98%。real-time PCR结果表明，follistatin基因能在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、卵巢和垂体中检测出来，在肾脏中表达量相对较高，在垂体中表达量较低。肾脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）；心脏中follistatin mRNA含量显著高于垂体中follistatin mRNA含量（P＜0.05）；其余各组织间follistatin mRNA含量差异均不显著（P＞0.05）。【结论】成功克隆出大足黑山羊follistatin基因cDNA序列，该基因在肾脏中的表达高于其它组织。     

苎麻ACC氧化酶基因（BnACO1）的克隆及表达

【目的】克隆苎麻中的一个ACO基因（BnACO1）,并对其进行生物信息学分析、表达分析、胁迫应答分析。【方法】通过RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆该基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白质序列进行分析。利用实时荧光定量PCR分析BnACO1在苎麻不同部位的表达量以及在ABA、干旱和高盐胁迫下的应答。【结果】BnACO1的cDNA序列全长为1 476 bp,其开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸多肽,预测其分子量和等电点分别为36.81 kD和4.95,基因登录号为JX878855。与无花果（AB307720）、香叶天竺葵（U19856）、柿树（AB073009）、梨（JN807390）、猕猴桃（HQ293208）的ACO基因核苷酸序列相似性分别为83%、81%、79%、79%和79%,氨基酸序列的相似性分别为87%、80%、80%、78%和83%。实时荧光定量PCR分析表明苎麻BnACO1在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根、茎中表达最低,且该基因受ABA、干旱和NaCl胁迫诱导表达。【结论】获得的BnACO1是ACO家族成员之一,参与ABA、干旱、NaCl胁迫应答,该基因可能在苎麻性别分化中起到一定作用并且在调控苎麻生长发育和应对环境胁迫时具有独特的表达模式。     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

指天蕉β-1，3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

 【目的】克隆植物中主要的防卫基因β-1, 3-葡聚糖酶基因，为该基因功能研究和有效利用提供理论依据。【方法】通过分析芭蕉科植物的β-1,3-葡聚糖酶基因，据其保守区域设计一对简并引物，通过RACE法从野生指天蕉中克隆得到一个β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA——glu。【结果】glu全长为1 114 bp，其推导的氨基酸序列与GenBank中其它来源的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性为54%—71%。其中，与芭蕉科植物Grand Nain的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性最高（71%）。【结论】在芭蕉类作物中克隆了一个新的β-1，3-葡聚糖酶基因,为进一步研究该基因的功能并应用于作物转基因抗病育种研究奠定了基础。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。