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[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SaⅠl将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。 相似文献
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[目的]观察拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450在毕赤酵母体系中的表达,获得重组蛋白。[方法]将At2G34450基因插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的酵母表达载体pPIC9K中,用SalⅠ将重组质粒线性化,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,筛选阳性整合子进行甲醇诱导表达。[结果]拟南芥At2G34450在酵母培养基中实现了表达,表达产物经SDS-AGE鉴定为重组蛋白。[结论]在毕赤酵母真核系统中实现了拟南芥At2G34450蛋白的表达,为进一步研究拟南芥HMGB家族蛋白打下了基础。 相似文献
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葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)广泛用于食品加工、饲料添加剂、生物传感器及工业生产等领域。较曲霉而言,毕赤酵母是更具高效生产GOD潜力的微生物,其副产物少,分离纯化简单。但由于外源基因、基因剂量以及分泌信号等因素的影响,毕赤酵母GOD产量仍然较低,限制了GOD在食品加工等领域的大规模应用。基于毕赤酵母密码子偏好性和mRNA二级结构能量,对毕赤酵母重组表达盒中的α因子信号肽进行改造,得到4种含有不同信号肽的毕赤酵母重组菌株。结果表明,使用含最高密码子频率信号肽α1重组菌株的GOD酶活力是出发菌株的2.01倍;而使用含低密码子频率信号肽α4重组菌株的GOD酶活力仅为出发菌株的41%。综上所述,毕赤酵母表达载体中的信号肽核酸序列排布能够影响重组GOD的表达量,为提高毕赤酵母重组蛋白表达量提供了新的研究思路。 相似文献
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黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究 总被引:2,自引:1,他引:1
应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。 相似文献
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根据毕赤酵母Pichia pastoris表达系统对于密码子的偏嗜性,将去除信号肽的猪α干扰素(PoIFN-α)基因重新设计改造并合成一段新的核苷酸序列,置于毕赤酵母菌α因子分泌信号的DNA序列后,构建成pPICZαC-PoIFN-α分泌型重组表达载体,电转化进入野生型毕赤酵母菌X-33中,经ZeocinTM抗性筛选后... 相似文献
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利用PCR技术从长白猪全血基因组DNA中扩增出猪α干扰素的成熟肽(mPoIFN-α)基因,并将其亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母(Pichia pastoris)-大肠杆菌(Escherichia coli)穿梭质粒pPIC9K载体中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFN-α。将SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFN-α电转化毕赤酵母GS115株(组氨酸缺陷型),使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组。转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以G418抗性梯度法筛选多拷贝重组子。该多拷贝菌株经1%甲醇诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明,猪α干扰素在毕赤酵母中成功地获得了分泌表达,并具有免疫活性,表达产物约为19kD,这为进一步研究猪α干扰素的功能奠定了基础。 相似文献
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膨胀素是一类可以诱导失活细胞壁伸展的蛋白质,试验通过克隆水稻膨胀素(OsEXP2)基因并在巴斯德毕赤酵母中表达,以研究其对纤维素的作用。根据已知序列设计引物,经RT-PCR克隆OsEXP2基因,并插入毕赤酵母表达载体pGAPHα中,位于α-信号肽下游,得到重组质粒pGAPHα-OsEXP2。将其线性化后通过电转化,转化毕赤酵母菌株GS115,OsEXP2基因通过同源重组整合到毕赤酵母的基因组上,得到重组菌株GS115/pGAPHα-O-sEXP2。该菌株发酵液可使滤纸发生崩解现象,并使纤维素酶滤纸酶活性(Filter Paper Enzyme Activity,FPA)提高了47.87%。 相似文献
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将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。 相似文献
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[目的]对抗菌肽SMAP-29的基因密码子进行优化,并使其在毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中表达。[方法]根据已知抗菌肽SMAP-29的氨基酸序列,参照毕赤巴斯德酵母密码子的偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,并同载体pPIC3.5K连接,电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。用甲醇诱导表达构建好的重组酵母表达基因工程菌,并裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析。[结果]在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的SMAP-29分子量相当,约为3.2 kD的表达带;表达产物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。[结论]该研究为SMAP-29在生物医学、农业等领域中的应用奠定基础。 相似文献
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来源于瓶霉Phialophora sp. G5的酸性木聚糖酶基因的克隆及性质的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
通过简并PCR和TAIL-PCR技术从瓶霉Phialophora sp. G5菌株基因组DNA中克隆得到一个新的编码b-1,4-木聚糖酶的基因,命名为xyn11G5。该基因ORF全长879 bp,共编码292个氨基酸和一个终止密码子,前19个氨基酸为信号肽序列。将xyn11G5在毕赤酵母中进行分泌表达,重组蛋白经纯化达到电泳纯。酶学性质分析表明,该重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为5.0,在中性条件下具有良好的稳定性,并且具有一定的热稳定性,在饲料行业和生物能源行业领域具有潜在的应用前景。 相似文献
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用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性. 相似文献
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来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达 总被引:7,自引:1,他引:6
应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106I 相似文献
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一种来源于Bispora betulina的酸性木聚糖酶基因克隆及其酶学性质研究 总被引:2,自引:1,他引:1
利用简并PCR和TAIL-PCR技术从嗜酸性真菌Bispora betulina中克隆得到一个酸性木聚糖酶基因xyn11BB。该基因全长1 207 bp,含有三段内含子、一段外显子和一个终止密码子,编码由297个氨基酸组成的蛋白质,推测蛋白质含有一个CBM1结构域。将不带原基因信号肽编码序列的cDNA基因以正确阅读框架克隆到表达载体pPIC9上,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中诱导表达,其表达活性达121.15 U/mL。重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH为4.5,在酸性条件下具有良好的活性和稳定性,可作为饲料用酶的备选。 相似文献