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相似文献
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1.
以16S rRNA、ask、mapA和cstA基因为靶基因,基于软件设计引物,建立牛源弯曲菌多重PCR检测方法.通过反应条件的优化以及引物特异性、灵敏度的验证,并与其他方法进行临床样品的检测效率比较,建立同时检测3种牛源致病弯曲菌的多重PCR方法.结果 表明:扩增的目的 条带处出现与预期大小相符的单一明亮条带,引物序列与NCBI的Primer-Blast库已有的菌株同源性均大于99%.应用建立的多重PCR方法对牛养殖场、屠宰场的样品进行检测,同时使用传统平板分离法及现有报道的其他PCR方法进行对比验证,在1375份样品中,多重PCR检测方法、传统平板分离法及其他PCR方法的检出率分别为5.45%(75/1375)、4.87%(67/1375)和5.31%(73/1375),但3种方法的检出率无显著差异.多重PCR方法与现有报道的PCR方法在DNA水平上的最低检测限:空肠弯曲菌分别为19.23、0.93 pg·μL-1,结肠弯曲菌分别为16.93、1.05 pg·μL-1,胎儿弯曲菌分别为14.37、0.23 pg·μL-1.多重PCR方法检测流程需1~2d,且可同时检测3种弯曲菌.而现有报道的PCR方法检测流程需1~2 d,还需制备不同体系分别验证,材料成本更高,传统平板分离法鉴定耗时更久,需5~7 d.这一研究建立的多重PCR检测方法优势表现为操作方便、灵敏度和特异性较高,能同时检测牛源弯曲菌常见种属,可满足牛源弯曲菌规模化检测的需求.  相似文献   

2.
为做好畜禽疾病防控及动物性食品安全评价,根据空肠弯曲菌的16S rDNA基因和马尿酸酶基因(hipO)分别设计2对特异性引物,建立双重PCR方法用于空肠弯曲菌的检测。通过对参考菌株的测定,确定了其特异性高、灵敏度强,最小检出的DNA浓度达1 pg·μL~(-1)。在采集的540份临床健康羔羊肛拭子样品和92份患病畜禽肠道样品中,共检出10份样品为空肠弯曲菌阳性,其中羊、鸡、鹅的阳性检测率分别为0.74%、10.5%和12.5%。通过细菌分离纯化,获得了10株空肠弯曲菌。体外培养试验发现羊源分离株生长速度低于鸡源和鹅源分离株。药敏试验表明所有分离株对磺胺类药物完全耐药;对头孢菌素类、四环素类、喹诺酮类药物的耐药性较高,且所有菌株均为多重耐药菌株。  相似文献   

3.
【目的】空肠弯曲菌是一种重要的人畜共患病致病菌,主要经被污染的水源、乳制品、生禽肉进行传播,建立快速、准确的诊断方法是防控空肠弯曲菌感染的重要措施。【方法】本文引入一种新型的核酸检测技术——DNA环介导恒温扩增 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP),以空肠弯曲菌ORF-C序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌LAMP快速检测方法。【结果】利用本LAMP方法对21种病原菌进行检测,仅空肠弯曲菌为阳性结果,说明该方法具有高度的特异性。该LAMP方法对空肠弯曲菌纯培养菌的检测灵敏度达6CFU/反应管,对污染材料中空肠弯曲菌的检测灵敏度为9CFU/反应管。【结论】本研究建立的空肠弯曲菌LAMP检测方法操作简便、检测快速,具有良好的实用性。  相似文献   

4.
利用PCR技术检测鸡肉产品中的空肠弯曲杆菌   总被引:7,自引:0,他引:7  
根据空肠弯曲杆菌旋转酶基因(gyrAgene)的保守序列,设计1对引物,建立了快速检测鸡肉中空肠弯曲杆菌的PCR方法。采用该方法和生化试验对送检的100份鸡肉样品进行检测,结果表明:PCR方法能特异性地扩增出空肠弯曲杆菌192bp核苷酸片段,其它结肠弯曲杆菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、绿脓假单胞菌等均不能获得阳性扩增结果。检测限度为8cfu/mL。鸡肉肉水、增菌液和纯培养菌落的PCR鉴定结果,阳性率分别为16%、24%和20%,生化鉴定检出率为20%。  相似文献   

5.
【目的】建立一种精准、高效的草甘膦抗性基因G2-EPSPS和GAT的检测方法,为转基因大豆新品系ZH10-6的广泛应用提供技术支持。【方法】根据抗草甘膦大豆ZH10-6和受体中黄10的分子特征,设计大豆内源参考基因(Actin)、外源基因(G2-EPSPS和GAT)以及侧翼序列(G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2)的特异性引物,通过PCR扩增测试引物的特异性和适用性。调整引物配比、DNA模板量、dNTP含量、退火温度和延伸温度等,筛选该多重PCR体系的最适扩增条件。将转基因大豆ZH10-6和受体中黄10的基因组DNA按质量比混合,制备成100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0的DNA样品,进行灵敏度检测。运用建立的多重PCR体系检测转基因大豆ZH10-6不同地理来源的11份衍生品系,并根据鉴定结果对该体系的应用性进行评价。【结果】建立的多重PCR方法中引物GmActin11 F/R、G2-EPSPS F/R、GAT F/R、ZH10P1/GAT和G2/ZH10P2可分别扩增出转基因大豆ZH10-6大小为126、430、338、810和1 626 bp的特异性目标条带。用该方法扩增受体中黄10时,除了GmActin11 F/R可以扩增出126 bp目标条带,侧翼序列上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2也可以扩增出632 bp目标条带。多重PCR最适扩增体系为DNA模板量100 ng、5 U·μL-1 Ex Taq 0.2μL、10×ExTaq Buffer 2.5μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2μL、10μmol·L-1引物(GmActin11 F/R 0.4μL、G2-EPSPS F/R 0.6μL、GAT F/R 0.4μL、ZH10P1/GAT 0.6μL和G2/ZH10P20.6μL),ddH2O补足25μL。多重PCR扩增最适程序为95℃5 min;95℃30 s,60℃30 s,68℃1 min 20 s,35个循环;72℃12 min。该多重PCR体系灵敏度为0.5%,符合欧盟有关转基因产品标识的要求。该多重PCR方法特异性很强,可以成功检测受体中黄10、转基因大豆ZH10-6及ZH10-6不同地理来源的11个衍生品系。【结论】建立的转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系具有高通量、特异性强、操作简便和应用广泛的优点,并且能够快速、准确地检测转基因大豆ZH10-6及其衍生品系。  相似文献   

6.
三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌   总被引:6,自引:1,他引:5  
王楠  王剑  尹丹韩  高观朋  王伟 《中国农业科学》2010,43(21):4392-4400
【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。  相似文献   

7.
为建立在临床样本能够同时检测猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌的多重PCR方法,根据NCBI已收录的布鲁菌全基因,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立能够同时检测4种布鲁菌的多重PCR诊断方法。特异性试验结果表明,可以从4种布鲁菌以及4种细菌混合物中扩增出大小分别为276、494、733和976bp的特异性条带,对照组的检测结果为阴性;敏感性试验结果表明,对4种病原菌基因组DNA的检出量为猪种32.2pg、牛种21.3pg、羊种27.5pg、绵羊种43.2pg;人工模拟感染样本检测结果表明,能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。应用该方法对200份临床奶山羊乳样进行检测,结果检出4份阳性。建立的多重PCR方法具有特异性强、敏感度高、稳定性好的特点,可以有效地检测4种布鲁菌的感染。  相似文献   

8.
为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。  相似文献   

9.
为建立快速检测葡萄灰霉病菌的方法,根据ITS序列的差异,设计了1对葡萄灰霉病菌PCR检测的特异性引物TBCF/TBCR,并利用该引物通过常规和巢式PCR对葡萄灰霉病菌进行检测。结果显示,在优化的反应体系与扩增条件下,只有以葡萄灰霉病菌基因组DNA为模板的扩增体系中具有1条386 bp的条带,而其它病菌不产生扩增反应;其常规PCR对葡萄灰霉病菌基因组DNA的检测灵敏度为100 pg/25μL,而利用引物ITS1/ITS4和TBCF/TBCR通过巢式PCR扩增,其灵敏度可达10 fg/25μL。研究表明建立的PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测准确而操作简单快速等特点,可用于带菌土壤及发病组织中葡萄灰霉病菌的检测。  相似文献   

10.
为建立一种能同时快速检测H5、H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的多重PCR检测方法,根据GenBank发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因和DTMUV的NS5基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了同时检测H5亚型AIV、H9亚型AIV和DTMUV的多重PCR检测方法,对其特异性及敏感性进行检验,并在临床中进行初步应用。结果表明,该多重PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可同时扩增出大小分别为732bp(H9亚型AIV)、380bp(H5亚型AIV)、250bp(DTMUV)的特异片段,利用本试验建立的多重PCR对其他鸭病病原体进行扩增结果均为阴性,利用这3对引物对H5、H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为533pg·μL-1、56pg·μL-1和6.6ng·μL-1。对临床200份样品的检测结果表明该多重PCR检测方法具有快速、敏感、特异性强等优点,适用于临床检测应用。  相似文献   

11.
空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法的建立   总被引:1,自引:0,他引:1  
针对空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)旋转酶基因(gyrA gene)设计特异性引物和探针,将生物素和地高辛分别标记上游引物5'端和核酸探针3 '端,并对反应条件进行优化,建立空肠弯曲杆菌PCR-ELISA检测方法.结果表明:该方法能特异的检测空肠弯曲杆菌基因组DNA,检测阈值为2fg,敏感性是常规PCR的10倍.对模拟泄殖腔样本进行检测,检测限为50 cfu/mL.对100份临床样品进行检测,PCR和PCR-ELISA方法阳性检出率分别为60%和69%.  相似文献   

12.
为了解2019年浙江和福建动物源沙门氏菌和弯曲杆菌流行情况及其耐药特征,于2019年在浙江和福建共10市随机采集新鲜粪便和肛拭子样品共计1 480份,参考国家标准方法分离沙门氏菌和弯曲杆菌,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)方法进行菌种鉴定,并使用微量肉汤稀释法分别检测沙门氏菌和弯曲杆菌对16种和9种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。本研究从2省样品中共计分离了100株沙门氏菌和100株弯曲杆菌,其中94株沙门氏菌被鉴定出血清型,包括11种血清型,优势血清型为策维埃(20.2%)、肯塔基(15.9%)、韦太夫雷登(15.9%)、鼠伤寒(14.9%)、肠炎(14.9%)。药敏检测结果显示:分离出的沙门氏菌对四环素的耐药率最高(76%),其次为氨苄西林(70%)、磺胺异恶唑(65%),对奥格门丁(6%)的耐药率相对较低,对美罗培南全部敏感;分离出的弯曲杆菌对环丙沙星(99%)、萘啶酸(88%)和四环素(87%)的耐药率最高,对庆大霉素的耐药率较低(23%)。结果表明,浙江和福建2省动物源沙门氏菌和弯曲杆菌耐药水平较高,多重耐药情况普遍,影响畜产品质量安全,可对公共卫生安全构成威胁,需要提高警惕。  相似文献   

13.
温度和培养基对空肠弯曲菌冻融耐受性的影响   总被引:1,自引:1,他引:0  
比较了15株不同动物来源的空肠弯曲菌的冻融耐受性,结果表明,不同动物来源的菌株间冻融耐受性差异极显著(P<0.01),但与其来源动物不相关.并分析了—10℃~37℃、—25℃~37℃两种冻融温度和FMPG、P—基、MSG、布氏半固体4种培养基对该菌冻融耐受性的影响,认为温度与培养基间存在极显著的互作现象(P<0.01),4种培养基对该菌耐受性的影响差异极显著,其中以FMPG和P—基对该菌冻融耐受性的增强效果最佳(66.2%和63.9%),MSG的效果中等(52.5%),布氏半固体最差(31.2%)。在—10℃~37℃下,以P—基最优(62.7%).在—25℃~37℃下,以FMPG最优(70.2%).对MSG而言,—10℃~37℃下(59.6%)优于—25℃~37℃温度下(45.3%)。  相似文献   

14.
15.
空肠弯杆菌是一种人兽共同感染的病原菌,也是导致腹泻最常见的病菌,主要症状是发热和急性肠炎。主要从病原的生物学特征、肠毒素的研究、人畜带菌率及流行病学的研究现状进行综合讨论。  相似文献   

16.
空肠弯曲杆菌是一种在世界范围内普遍存在的人畜共患病病原,生存条件严苛.研究发现,该菌在一定条件下可以形成一种能够抵抗外界环境不良影响生物膜,这也是该菌能够在恶劣环境中存活并产生耐药性的重要原因.文章选取临床分离空肠弯曲杆菌为研究对象,建立其生物膜体外模型,通过PCR、扫描电镜等一系列方法对空肠弯曲杆菌生物膜进行鉴定.正交试验法对培养基、温度以及空气条件三种因素对空肠弯曲杆菌生物膜形成影响进行研究.结果表明,体外生物膜形成最佳条件为MHB培养基、37℃和常规空气条件.  相似文献   

17.
訾臣  曾德新  蒋鲁岩  袁飞  蒋原  薛峰 《安徽农业科学》2017,45(32):156-160,183
[目的]对空肠弯曲菌空肠弯曲菌flaA基因的序列及功能进行预测分析。[方法]分析了多个空肠弯曲菌flaA核酸及氨基酸序列组成和序列差异性;预测分析了flaA基因密码子使用偏好性、蛋白结构和功能域、Fla A与相关功能蛋白的互作情况。[结果]不同菌株的flaA基因序列存在差异性,且差异主要存在于序列的中间区域。不同空肠弯曲菌菌株的同一基因在密码子选择上存在差异。Fla A与多个蛋白存在不同形式的相互作用。[结论]该研究可为空肠弯曲菌flaA基因序列分析和功能研究应用提供基础和依据。  相似文献   

18.
蛋鸡和鲜蛋空肠弯曲菌带菌状况的研究   总被引:3,自引:1,他引:2  
对420只蛋鸡和200枚鲜蛋进行了空肠弯曲菌检查。结果表明,蛋鸡平均带菌率为66.2%,在43~46用龄时带菌率最低(34.0%),26~28周龄时带菌率最高(92.0%),19~20周龄时带菌率居中(45.3%),差异极显著(P<0.01)。在200枚鲜蛋中未检出空肠弯曲菌。对15只空肠弯曲菌阳性蛋鸡进行该菌在体内分布的研究表明,十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠和泄殖腔为空肠弯曲菌的主要栖居场所,在咽喉、腺胃、卵巢和输卵管内也有该菌检出,而在嗉囊中未检出该菌。同时,对蛋清抑制空肠弯曲菌的平板试验显示,蛋清没有抑菌作用。本文并对空肠弯曲菌在鸡体的垂直传播途径进行了讨论,认为空肠弯曲菌不经鲜蛋而垂直传播于仔鸡。  相似文献   

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