TcLr24小麦NBS-LRR同源基因的克隆与分析

目前已克隆的小麦抗叶锈病基因多数含有NBS类保守结构域,为克隆高抗叶锈病Lr24基因及其抗病相关基因,根据NBS保守结构域设计引物,对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24cDNA进行扩增,得到534bp的抗病基因同源序列。对该序列进行同源性检索并验证,获得1 408bp的电子延伸序列。以此通过RACE技术分别获取2 797bp和3 466bp的cDNA与gDNA全长产物,其翻译的蛋白质序列含有NBS保守区的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD和LRR保守结构,与大麦等单子叶植物NBS类蛋白序列同源性较高,生物信息学分析表明其为稳定的亲水性蛋白,分子质量104.28ku,理论等电点6.15。半定量RT-PCR表明该片段所在基因序列为组成型表达。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。     

小麦NBS-LRR类抗病基因类似片段分离和定位

【目的】利用同源序列法分离小麦NBS-LRR类抗病基因类似片段,并验证其与小麦抗条锈病基因Yr26之间的关系。【方法】根据已克隆R（抗病）基因的保守结构域（NBS-LRR）设计简并引物,采用巢式PCR（Nested PCR）技术对小麦Yr26近等基因系材料Nan137的基因组DNA进行扩增;同时利用中国春缺失系对获得的抗病基因类似片段进行染色体定位分析,利用Yr26载体品种92R137和感病品种Avcoet S（AvS）创制的F2:3后代群体验证获得的片段与小麦抗条锈病基因Yr26的关系。【结果】通过巢式PCR方法,获得了4个通读的小麦抗病基因NBS-LRR 类抗病基因同源片段R105、R181、R326和R405,长度分别为369、589、528、618 bp;这4个片段均具有典型的NBS-LRR类的保守结构域,其核苷酸相似性为24.35%—38.36%。中国春缺失系定位结果显示片段R405被定位于Yr26所在的小麦缺失系C-1BL-6-0.32区段内,同时通过含196个单株的小群体检测结果表明该片段与Yr26共分离。【结论】从小麦近等基因系材料Nan137中获得了4个RGAs片段,其中片段R405可能是小麦抗条锈病基因Yr26的候选片段,但需进一步验证该候选片段的真实性。     

TcLr35小麦中抗病相关基因S2A2的抗叶锈性分析

NBS-LRR是已克隆植物抗病基因的高度保守氨基酸区域。前期工作中,笔者成功克隆获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S2A2的cDNA序列,该序列含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域,且在小麦叶片中为低丰度组成型表达。进一步根据S2A2基因在TcLr35与Thatcher中扩增获得的基因序列差异位点设计特异性引物,分别以TcLr35、Thatcher为模板进行扩增,筛选出了具有较高稳定性和可重复性的3对引物。利用3个多态性引物对TcLr35、Thatcher及其F2代群体进行扩增和遗传性分析,并用Mapmanager软件计算分子标记与抗叶锈病基因之间的遗传距离,结果发现这3对引物获得的标记与Lr35基因遗传距离较远。利用这3个多态性引物扩增33个不同小麦抗叶锈病近等基因系材料,并回收测序,结果表明该基因序列在不同近等基因系材料中广泛存在。     

水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal(AB002266)的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。     

桃基因组中R类抗病基因同源序列的克隆与序列分析

许多抗病基因均具有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复区(LRR)。根据已知的NBS-LRR型抗病基因蛋白质的保守序列,设计简并引物,用以扩增桃基因组中的抗病基因同源序列。获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到4个NBS-LRR类抗病基因同源片段(PNBS1、PNBS2、PNBS3、PNBS4)。推导的氨基酸均具有P-loop(激酶1a)保守区和中间的激酶2a、激酶3a保守区,除PNBS4外,均具有3端疏水结构域。它们与已克隆的N、L6、PRS2 等抗病基因在核苷酸水平上的同源性为21 1%~58 8%;在氨基酸水平上的同源性为18 8%~41 4%。这些抗病基因同源片段(RGA)可做为分子标记筛选桃的抗病候选基因。     

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

 【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物，以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列（resistance gene analogs，RGAs），聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2 基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%，确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分，即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列，为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。     

小麦抗赤霉病品种宁7840中抗病基因TaLRG的cDNA克隆和特性分析

为探索小麦NBS-LRR类抗病基因的克隆方法、功能及作用机制,从小麦抗赤霉病品种宁7840中通过RT-PCR和RACE技术(末端快速扩增技术)得到一个新的NBS-LRR类抗病基因同源序列,命名为TaLRG,开放阅读框3063bp,编码1021个氨基酸,具有NBS保守结构域和多个亮氨酸重复序列.聚类分析发现其编码蛋白质与...     

结球甘蓝NBS-LRR类R基因同源序列的分离

 根据大多数抗病基因编码蛋白质的核苷酸结合区(NBS)和富含亮氨酸重复序列(LRR)保守区域的特点,设计PCR特异简并引物,从抗TuMV的结球甘蓝材料84075中,扩增出513 bp的DNA片段,经克隆、测序后,得到4个含有NBS-LRR保守区域的R基因同源序列,分别命名为:Bor1、Bor2、Bor3和Bor4,同源性比较分析表明,它们与已克隆的抗病基因或抗病基因片段有不同程度的同源性。以Bor1为探针,对84075进行Southern blot和RFLP分析的结果表明,Bor1以多拷贝形式存在。     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本，利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增，对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序，并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF，对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增，验证该标记与Lr45的连锁关系，Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带，片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272），而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析，遗传距离为8.2 cM，该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。     

小麦抗叶锈病基因Lr24的TRAP分析

 【目的】获得与Lr24基因紧密连锁并可能作为探针的TRAP分子标记。【方法】应用TRAP技术，选用90对引物组合对小麦抗叶锈病基因Lr24、感病亲本Thatcher及其F2代抗感各10株组成的抗、感基因池（Br、Bs）的扩增带型差异进行分析，用筛选获得的多态性引物对TcLr24×Thatcher F2群体进一步筛选，进而用获得的特异引物对45个小麦抗叶锈病近等基因系和30个小麦二倍体材料进行分析。【结果】获得10对能够在TcLr24、Br与Thatcher、Bs间产生多态性的引物，多态性引物检出率为11.11%。其中1对在F2抗感群体中有差异且稳定扩增的TRAP引物ARBI1/RGA-2F，其161bp 扩增产物仅在F2抗病单株中出现，感病单株中缺失。用该引物对45个近等基因系和30个二倍体材料检测发现，近等基因系TcLr19、TcLr29、TcLr38、Lr42和TcLr44中有相同大小片段的扩增产物，30个二倍体材料中未出现相应扩增产物。【结论】本研究获得的一个与Lr24紧密连锁的TRAP标记，该标记可筛选含有Lr24基因的育种后代群体，可作为探针用于文库的筛选。     

叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中PR1基因的克隆及分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得1个病程相关蛋白1(Pathogenesis-related proteins 1,PR1)基因,暂命名为TcLr19PR1。该基因长度为810bp,包含495bp ORF区,编码164个氨基酸,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与多个植物病程相关蛋白1基因具有较高同源性。利用半定量分析表明,TcLr19PR1基因受叶锈菌诱导后表达量变化明显,非亲和组合表达高于亲和组合。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。利用‘中国春’缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上,为进一步明确叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中病程相关蛋白1基因的抗叶锈相关性奠定了基础。     

叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析

【目的】β-1, 3-葡聚糖酶是一种病程相关（pathogenesis-related,PR）蛋白,了解小麦TcLr35中β-1, 3-葡聚糖酶基因在叶锈菌（Puccinia triticina）与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1, 3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生长时期的基因表达模式。【结果】小麦TaLr35PR2含有信号肽,编码定位于液泡的碱性蛋白,蛋白序列与其他物种PR2类蛋白序列具有较高同源性,与普通小麦病程相关蛋白2亲缘关系最近,与水稻病程相关蛋白亲缘关系最远。小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2在亲和反应（Thatcher）中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应（TcLr35）中的表达有显著差异,总体上,该基因在非亲和组合中表达量明显高于亲和组合中表达量。检测TaLr35PR2在成株小麦TcLr35各器官中基因表达,该基因在叶片中表达量随接菌时间点延长明显增加,并在接菌后48 h达到表达高峰;而在根中接菌后各时间点均未检测到基因表达;在茎中接菌后48 h开始有少量表达,但表达量变化不大,趋于平缓,总体表达丰度为叶＞茎＞根。在小麦生长发育的不同时期,除1叶期外,该基因在TcLr35和Thatcher中均有表达,Mock（未接菌处理）反应中,TaLr35PR2在小麦不同生长期的表达呈上升趋势;接种叶锈菌后,TaLr35PR2在亲和反应和非亲和反应小麦各生长时期的表达量均高于Mock反应,且在成株期表达稳定。信号分子水杨酸（salicylic acid,SA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）均能诱导该基因的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,基因表达量显著上调。【结论】TaLr35PR2的表达受叶锈菌诱导,TaLr35PR2可能参与SA、ABA介导的信号通路,并参与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应。     

小麦类受体蛋白基因TaRLP19 cDNA序列克隆及分析

为筛选小麦叶锈病抗病相关基因,以从小麦近等基因系TcLr19中获得的特异表达的168 bp cDNA-AFLP片段为靶序列,通过cDNA末端快速扩增(RACE)的方法获得2545 bp的cDNA序列,并在接菌的TcLr19叶片中进行RT-PCR验证,测序结果与RACE结果一致.tBLASTn比对发现该序列与预测的二穗短柄草的Receptor-like protein 2-like (LOC100825532)有67％的一致性(Expect=0.0).该基因包含一个2136 bp的开放阅读框,编码711个氨基酸；SMART分析表明其含有6个LRR结构域,属LRR-TM类型,推测其为假定的富含亮氨酸的类受体蛋白基因,暂命名为TaRLP19,GenBank登录号为(JN872563).半定量RT-PCR分析表明,该基因属组成型特异表达类型.为进一步研究叶锈菌与小麦TcLr19非亲和反应中类受体蛋白TaRLP19的功能及其表达调控机制等奠定基础.     

小麦NBS类序列的分离与特征分析

[目的]获得小麦近等基因系TcLr24中NBS类抗病基因同源序列。[方法]利用已克隆植物抗病基因NBS序列中的保守结构＂P-loop＂和＂GLPL＂合成简并引物,以小麦近等基因系TcLr24基因组DNA为模板进行PCR扩增。[结果]得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物序列,包括P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、GLPL抗病基因所共有的保守结构,相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在36.1%～98.3%,同时对分离的RGAs的氨基酸序列和5个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行聚类分析表明,与Xa1、RPS2亲缘关系较近,而与Lr21亲缘关系较远。[结论]TcLr24中NBS类RGAs可能会有与Lr21不同机制的抗病功能。     

Isolation and Characterization of NBS-LRR Class Resistance Homologous Gene from Wheat

One resistance gene analog fragment named RGA-CIN14 was isolated from TcLr19 wheat,which contains kinase-2,kinase-3a,and the GLPL motif of the NBS-spanning region,using degenerated primers according to the nucleotide binding site (NBS) conserved domain.Based on the RGA-CIN14,a full-length cDNA,CIN14,which was 2 987 bp encoding 880 amino acids,was obtained by using the method of the rapid amplification cDNA ends (RACE).Bioinformatics analysis showed that the deduced amino acids of CIN14 protein consisted of a NB-ARC conserved domain and many leucine-rich repeats (LRR) domains.The phylogenetic tree analysis indicated a considerable identity of the protein encoded by CIN14 with that of wheat leaf rust resistance gene Lr1,but a lower similarity with Lr21.The expression profile of the CIN14 gene detected by semi-quantitative RT-PCR showed that the CIN14 gene was not induced by Puccinia triticina and it was a constitutive gene with low abundance in the wheat leaf tissue.The resistance homology sequence was successfully obtained,which provides the shortcut for cloning of the resistance gene in TcLrl9 wheat.