中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。     

意大利蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的可变剪接基因分析

为探讨可变剪接基因在宿主响应球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫过程中的作用,基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)幼虫肠道转录组数据进行可变剪接基因分析。在正常的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK),球囊菌胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫肠道(AmT1、AmT2、AmT3)中共鉴定出55 895个可变剪接事件,以外显子跨越和可变3′端剪接为主。各样品的共有可变剪接基因数为8 157个,AmT1、AmT2、AmT3的特有可变剪接基因数分别为207、334和542个。GO分类结果显示共有可变剪接基因分布在50个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,共有可变剪接基因富集在290个pathway,基因富集数最多的是内质网蛋白加工、RNA运输和碳代谢。上述分析结果揭示了可变剪接基因在意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫过程中的重要作用,为深入研究可变剪接基因的功能打下了基础。     

基于比较转录组学分析揭示中华蜜蜂及意大利蜜蜂幼虫的球囊菌抗性差异机制

为探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称中蜂)与意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,以下简称意蜂)幼虫的球囊菌(Ascospahaera apis)抗性差异产生的原因,利用Venn分析、GO分类分析、KEGG代谢通路分析以及Ka/Ks分析对二者的转录组进行比较研究。Venn分析结果显示,中蜂与意蜂的同源基因有17 656个,归属于8 111个基因家族,二者的特有基因分别有1 158和241个,分别归属于468和86个基因家族。GO分类结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集在38和28个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集于96和21个代谢通路;进一步分析发现中蜂的特有基因富集在内吞作用、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和黑化作用等4个细胞免疫通路,以及MAPK信号通路和Toll-like受体信号通路等2个体液免疫通路,而意蜂仅有1个特有基因富集在MAPK信号通路。Ka/Ks分析结果显示受到强烈正向选择、弱正向选择、中性选择和负向选择的单拷贝同源基因分别有37、281、2 630和3 269个。对受到强烈正向选择的基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析,GO结果显示中蜂和意蜂的单拷贝同源基因富集的GO条目类型相同;KEGG结果显示中蜂的单拷贝基因仅富集在氧化磷酸化。上述结果表明免疫相关基因数量的差异是二者的球囊菌抗性差异产生的重要原因之一,中蜂在与球囊菌的协同进化过程中可能通过提高能量利用从而限制球囊菌的增殖。本研究结果可为阐明中蜂及意蜂幼虫的球囊菌抗性差异产生的分子机制提供参考。     

意大利蜜蜂幼虫响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的高表达基因分析

为探究意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)幼虫响应东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)胁迫的高表达基因(HEG)的作用,利用RNA-seq技术对正常的意蜂4、5和6日龄幼虫(Am4CK、Am5CK和Am6CK)及N.ceranae胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫(Am4T、Am5T和Am6T)进行测序。共得到268 765 544条原始读段,经过滤得到的有效读段数为266 318 442条,各样品的Q30均在92.42%及以上。根据FPKM值≥15的标准从上述6个样品中分别筛选出2 460、2 692、2 908、2 367、2 549和2 270个HEG。Venn分析结果显示,去除与对照组共有的HEG,Am4T、Am5T和Am6T的共有HEG数为3个,特有HEG数分别为373、210和79个。GO分类结果显示,Am4T、Am5T和Am6T的特有HEG分别能够注释26、27和16个GO条目,注释基因数最多的分别是代谢进程、结合和结合。KEGG分析结果显示这些特有HEG可分别富集在145、138和68条代谢通路,富集基因数最多的分别是过氧化物酶体、碳代谢和内质网蛋白加工。进一步分析结果表明N.ceranae胁迫可导致宿主的部分物质代谢、能量代谢和免疫代谢通路水平提高。从6个样品的共有HEG中随机选取10个进行RT-PCR验证,均能成功扩增出目的条带,说明本研究中的HEG真实存在。研究结果揭示了意蜂幼虫响应N.ceranae胁迫的HEG表达谱及作用,为深入解析宿主的胁迫应答机制提供了重要信息。     

蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫

对健康和患病蜜蜂幼虫血淋巴进行SDS-PAGE电泳和蛋白酶、酯酶的活性染色,以研究蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶种类及对蜜蜂侵染的作用.结果表明:健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富,主要由4种高分子质量的蛋白组成,而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白组分被降解;在患病幼虫血淋巴中可以检测到健康幼虫所没有的多种蛋白酶和酯酶...     

基于RNA-seq数据大规模挖掘蜜蜂球囊菌的SSR分子标记

基于已获得的球囊菌转录组数据预测微卫星标记(SSR),并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的挖掘.利用软件MISA对球囊菌转录组中42610条unigenes进行搜索,共预测出7968个SSRs,分布于5233条unigenes中,其中最主要的重复类型为三核苷酸重复(53.15%),其次为二核苷酸重复(32.32%)和四核苷酸重复(8.46%).二核苷酸重复中的基序主要是AG/CT(占总量的15.8%).针对所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件设计出6956对SSR特异性引物,随机选取20对引物对两个不同来源的球囊菌样品进行SSR位点扩增,共有6对引物成功扩增出符合预期的目的片段.研究结果表明,利用球囊菌转录组数据开发SSR引物是可行的.     

基于中华蜜蜂幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂基因组的基因结构优化及新基因鉴定

利用前期获得的中华蜜蜂(Apis cerana cerana)幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂(Apis cerana)基因组的已注释基因进行结构优化、对未注释的新基因进行预测、分析和鉴定:利用Cufflink软件对reads进行转录本重构,通过与参考转录本序列进行比较,共对3 366个东方蜜蜂的基因结构进行了优化;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共预测出527个东方蜜蜂的新基因,其中234个新基因在Nr数据库中存在注释信息;随机选取12个新基因进行PCR鉴定,有11个能够扩增出符合预期的目的片段,表明多数预测出的新基因真实存在;GO分类和KEGG代谢通路分析结果显示上述新基因可能在东方蜜蜂的生长发育、物质代谢、遗传信息传递等方面具有重要功能。本研究结果丰富和完善了东方蜜蜂基因组的基因结构与功能注释信息,也为新基因的功能研究打下基础。     

蜜蜂球囊菌基因结构优化及新基因鉴定

为补充和完善蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis基因组序列和功能注释信息,本研究利用RNA-seq技术对球囊菌菌丝和孢子进行深度测序,并基于高质量的转录组数据对已注释基因进行结构优化,对未注释基因进行预测、鉴定和分析。将测序得到的有效读段进行参考基因组比对和转录本重构;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对。结果表明:共对101个已注释基因的5′端或3′端进行了延长;共鉴定出373个新基因,随机挑选10个新基因进行RT-PCR验证,其中8个能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的多数新基因真实存在;共计147个球囊菌新基因可注释到Nr和eggNOG数据库中,85个新基因注释到29个GO条目,66个新基因注释到33条代谢通路。本研究结果补充了球囊菌的基因结构和功能注释信息,也为新基因的功能研究打下了初步基础。     

中华蜜蜂CREB基因的克隆及表达

【目的】克隆中华蜜蜂（Apis cerana cerana）的cAMP反应原件结合蛋白（cAMP response element binding protein,CREB)基因全长cDNA序列,预测该基因及其编码蛋白的理化性质,并解析中华蜜蜂CREB在大脑中的表达特征,为研究该基因在中华蜜蜂学习记忆过程中的生物学功能提供基础。【方法】以中华蜜蜂为试验材料,解剖其大脑获得脑组织,提取大脑组织的总RNA。在此基础上,利用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂大脑的CREB基因(AcCREB),然后用DNAstar软件中的Seqman程序将CREB正反向测序后的序列拼接获得CREB基因的cDNA序列,其氨基酸序列通过Bioedit软件按照六框翻译而成;用BLASTn和BLASTp进行序列比对分析;用ClustalX进行多重序列比对和同源性比较;用MEGA软件的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,明确其系统进化关系。并通过SMART数据库分析AcCREB的结构域。另外,将解剖好的蜜蜂大脑制成石蜡切片,并采用地高辛原位杂交技术分析AcCREB在中华蜜蜂大脑中的分布表达情况。【结果】中华蜜蜂CREB基因的cDNA全序列全长890 bp,编码240个氨基酸残基,序列提交到GenBank（登录号为KC814690）。其编码的蛋白预测分子质量为25.691 kD,等电点为5.82。结构域分析结果显示,该蛋白具有AA 89-131的PKID和AA 176-237的BRLA两个保守结构域。氨基酸序列比对结果显示,中华蜜蜂与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂、印度跳蚁、家蚕、埃及伊蚊、疟原虫、人类、小鼠10个物种的同源蛋白相似度分别为98.76%、98.35%、97.11%、94.09%、72.22%、58.97%、44.69%、41.69%、36.89%、36.89%。系统发育树显示该基因编码的蛋白质与西方蜜蜂的CREB亲缘关系最近,与熊蜂、大黄蜂之间的亲缘关系次之。另外,经过地高辛原位杂交技术处理后,在中蜂大脑蘑菇体的凯尼恩细胞、触角叶周围的细胞和大脑的髓质与小叶之间的细胞均有阳性着色,而且AcCREB在中华蜜蜂工蜂左右大脑的阳性着色不对称。【结论】AcCREB的氨基酸序列与西方蜜蜂、熊蜂、切叶蜂、大黄蜂高度同源,且基因在大脑中的分布暗示其可能参与了中华蜜蜂学习记忆过程。     

感染意大利蜜蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫及其纯化孢子的高表达基因分析

为探究东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)在侵染意大利蜜蜂(Aips mellifera ligustica)过程的基因表达谱及高表基因(highly expressed gene,HEG)的功能,本研究利用RNA-seq技术对N.ceranae感染的意蜂工蜂7和10 d工蜂中肠(NcT1和NcT2)及其纯化孢子(NcCK)进行高通量测序。根据FPKM值≧15的标准筛选出各组的HEG并进行Venn分析,进而通过GO分类和KEGG代谢通路富集分析对各组的共有HEG进行功能注释。测序得到的原始读段经严格质控后分别得到5 816 465、28 501 225和210 824 312条高质量的有效读段,分别从NcT1、NcT2和NcCK中筛选出1 263、1 233和1 511个HEG,其中有1 079个基因在各组均高量表达,分别有15和7个基因仅在NcT1和NcT2中高量表达。GO分类结果显示,共有HEG涉及9个生物学进程相关条目,10个细胞组分相关条目,以及5个分子功能相关条目。KEGG代谢通路富集分析结果表明,共有HEG富集在218条代谢通路,富集基因数最多的是核糖体、Epstein-Barr病毒感染、细胞周期、内质网蛋白加工和真菌核糖体生物合成。深入分析结果显示分别有5和5个共有HEG富集在MAPK和cAMP信号通路,表明此2条信号通路及富集的HEG可能在N.ceranae的环境应激和侵染过程中发挥重要作用。研究结果提供了N.ceranae感染意蜂工蜂过程中的基因表达谱,揭示了HEG的作用,为深入解析N.ceranae的侵染机制打下了初步基础。     

中华蜜蜂幼虫肠道中微小RNA的鉴定及分析

[目的]利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术和生物信息学方法对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道的微小RNA(microRNA,miRNA)进行全转录组鉴定和分析,旨在丰富中蜂的miRNA信息,并为深入研究miRNA调控中蜂幼虫肠道发育的分子机理提供依据.[方法]利用s...     

亚致死剂量吡虫啉对中华蜜蜂神经代谢基因表达的影响

【背景】新烟碱类杀虫剂的作用靶标是昆虫神经系统中的乙酰胆碱受体,由于其良好的内吸性及对人畜低毒性,使其在农业生产上获得了广泛应用,然而这也使得其在植物体内仍然具有较低的残留,而这种亚致死剂量残留仍可对访花昆虫如蜜蜂的行为和神经系统造成不利影响。【目的】明确亚致死剂量新烟碱类杀虫剂吡虫啉对中华蜜蜂（Apis cerana cerana,简称中蜂）神经生理和代谢系统的影响。【方法】首先以两个亚致死浓度梯度剂量5和10 μg·L^-1吡虫啉处理工蜂10 d（3个生物学重复）,提取总RNA后,以RNA-seq方法对所得文库进行高通量测序,利用生物信息学技术对序列进行从头组装、注释,并对亚致死剂量吡虫啉处理后的差异表达基因进行聚类和富集等分析,最后利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术对部分与中蜂神经和代谢系统相关的差异表达基因进行验证。【结果】从两个吡虫啉浓度梯度和对照组数据中共获得9个测序文库,测序有效数据比例超过94.45%,从获得的37 364个unigenes中鉴定出571个差异表达基因。经GO和KEGG富集分析发现这些差异表达基因主要与蛋白质翻译、氧化还原、氧化磷酸化和核糖体等多个通路有关,表明亚致死剂量的吡虫啉对中蜂多个生理过程和代谢通路造成影响。挑选了与昆虫神经信号传递和代谢功能有关的上调或下调差异表达基因,如神经肽F、神经肽SIFamide受体、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶、激酶（PRKA）锚蛋白1、碳酸酐酶、超氧化物歧化酶、NADH脱氢酶亚基、表皮蛋白和气味结合蛋白17共9个差异表达基因进行了qPCR验证,其表达规律与转录组结果完全一致。【结论】亚致死剂量的吡虫啉能对中蜂神经信号转导、细胞呼吸、免疫反应、内环境稳态的维持和嗅觉感受等多方面造成影响。     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中微小RNA及其靶mRNA的比较分析

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,球囊菌)专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病。本研究旨在通过small RNA-seq(sRNA-seq)技术和生物信息学方法对球囊菌纯化菌丝(AaM)和纯化孢子(AaS)进行深度测序和比较分析,明确球囊菌菌丝miRNA和孢子miRNA的数量、结构和表达谱差异,并揭示菌丝和孢子共有miRNA、特有miRNA和差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEmiRNA)及其靶mRNA与球囊菌菌丝和孢子生长、发育和病原致病性的潜在关系。【方法】实验室条件下获得纯培养的球囊菌,利用sRNA-seq技术对AaM和AaS分别进行测序,通过对原始读段(raw reads)进行过滤和质控获得有效标签序列(clean tags)。通过Venn分析筛选菌丝和孢子共有miRNA和特有miRNA。根据P≤0.05且|log2 fold change|≥1的标准筛选AaM vs AaS的DEmiRNA。对上述共有miRNA、特有miRNA和DEmiRNA的靶mRNA进行预测,并对靶mRNA进行GO及KEGG数据库注释。根据靶向...     

中华蜜蜂群体内温度变化及调控的研究

为了保护中华蜜蜂(Apis cerana cerana)的遗传多样性,合理开发利用中华蜜蜂资源,用新法饲养和旧法饲养对安徽皖南山区的中华蜜蜂群体温度变化及调控进行了研究。结果表明,新法和旧法饲养的中华蜜蜂蜂团中心温度分别为:春季(32.57±0.29)℃和(32.78±0.60)℃,夏季(34.03±0.33)℃和(34.26±0.31)℃,秋季(32.19±0.26)℃和(32.39±0.26)℃,冬季(26.14±0.39)℃和(27.47±0.31)℃;边缘温度分别为:春季(22.24±1.77)℃和(22.49±1.78)℃,夏季(33.71±0.64)℃和(34.08±0.66)℃,秋季(19.27±0.54)℃和(19.68±0.52)℃,冬季(14.20±0.09)℃和(14.81±0.07)℃。新法和旧法饲养的蜂团中心温度与环境温度之间差异均极显著(P<0.01);夏季和冬季新法和旧法饲养的蜂团边缘温度与环境温度之间差异显著(P<0.05),春、秋季差异不显著;冬季旧法蜂团中心与边缘温度均高于新法。在环境温度剧变条件下,通过群体的调节,冷库中繁殖群蜂团中心温度保持30.5~32.6℃;温室中断子群蜂团中心温度保持27.8~31.8℃。     

中意蜂混合饲养对意蜂蜂螨寄生率的影响

选取4群群势相当的意大利蜂群(Apis mellifera ligustica),测定其蜂螨寄生率.然后在其中两群蜂中各加入一块带封盖子脾的中华蜜蜂(Apis cerana cerana)巢脾,使中意蜂合群饲养,30 d后再次测定4群蜂的蜂螨寄生率.结果表明:与对照组相比,加入中蜂子脾的两群蜂的蜂螨寄生率显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)下降.这说明往意蜂群中加入中蜂封盖子脾,可以提高意蜂蜂群的抗螨力.     

中蜂雄蜂封盖气孔结构及功能分析

以中华蜜蜂和意大利蜜蜂为实验材料,利用扫描电镜观察中蜂雄蜂封盖气孔形成过程和不同封盖结构,利用全自动数字式物透气量仪测定不同封盖透气性。结果表明:中蜂雄蜂封盖第7天,已形成气孔结构,直径0.4~0.5 mm;中蜂雄蜂封盖透气性显著低于中蜂工蜂、意蜂工蜂和雄蜂、封盖,并且中蜂雄蜂封盖质地结构紧密。人工封盖中蜂雄蜂气孔实验表明:中蜂雄蜂封盖气孔对雄蜂发育有一定影响。     

Cloning and Sequence Analysis of cDNA Encoding MRJP3 of Apis cerana cerana

By screening the worker （Apis cerana cerana） heads cDNA library using a fragment of the mrjp3 gene of Apis cerana as probe, 120 positive clones were obtained. The clone containing A. cerana cerana MRJP3 （AccMRJP3） cDNA was selected. Based on the sequencing of the inserts of the positive clone, a sequence of AccMRJP3 cDNA which is 1 887 bp long including a poly （A） tail was obtained. The AccMRJP3 cDNA encompassed an open-reading frame （ORF） with 1 779 bp encoding 593 amino acids. The un-translated regions （UTR） of the 5′ end and 3′end are 46 bp and 160 bp in length, respectively. Similar to AmMRJP3 and AdMRJP3, the putative AccMRJP3 also has a repetitive region. The comparison of the repetitive region of AccMRJP3, AmMRJP3 and AdMRJP3 shows some differences between them.