黑麦端部特异重复序列pSc200在新合成的不同小麦-黑麦双二倍体中的变异

【目的】更好地了解在小麦-黑麦双二倍体形成过程中,黑麦染色体变异的情况。【方法】利用黑麦Kustro及黑麦AR106BONE分别与小麦品种绵阳11杂交,获得两种双二倍体（MKS1及MARS1）。以黑麦亚端部串联重复序列pSc200为探针,采用荧光原位杂交的方法,分析亲本黑麦及相应的双二倍体中黑麦染色体端部染色体结构变化。【结果】检测到pSc200杂交位点在MKS1中减少,而在MARS1中增加。【结论】异源多倍体化过程中,染色体端部结构的变异是伴随多倍体化快速发生的。这可能有利于新合成的异源多倍体快速稳定,使得两个不同的基因组在同一核中协调共存。来自不同组合的小麦－黑麦双二倍体中,黑麦染色体结构发生不同的变异为黑麦在小麦育种中的应用提供了启示。     

非变性原位杂交技术在芝麻染色体识别上的探索与应用

【目的】研究和确定芝麻ND-FISH最优试验条件,并对其在芝麻染色体识别中的可行性进行探索。【方法】以寡聚核苷酸(AC)8为探针,研究不同洗脱强度、酶解时间和杂交时间对ND-FISH的影响,确定芝麻ND-FISH最优试验方案。【结果】芝麻ND-FISH最优方案：制片在浓度100 μg•mL-1 RNase A酶解1 h,探针浓度6 µL（20 ng•µL-1）,杂交4 h,4 × SSC/0.2% Tween 20溶液洗脱10 min;18条染色体存在(AC)8杂交信号,其中,14条染色体上存在较强杂交信号,4条染色体上有较弱杂交信号,结合染色体长度及臂比,18条染色体可有效识别。【结论】利用ND-FISH技术、以(AC)8为探针成功识别栽培芝麻的18条染色体。     

黑麦染色体组中一个新重复序列的发现、定位与应用

 【目的】寻找黑麦基因组中新的重复序列作为特异PCR标记。【方法】以普通小麦中国春、川农18、育成品系R111、绵阳11为对照，以荆州黑麦、秦岭黑麦、非洲黑麦、森林黑麦为材料，用RAPD法筛选到黑麦基因组中的一个高拷贝DNA片段OPD15940，将OPD15940输入到NCBI的BLAST框中进行比对。根据OPD15940设计特异PCR引物D15F和D15R，利用这对引物对小麦族物种进行扩增，验证OPD15940的特异性。进而利用原位杂交技术定位pScD15940在染色体上的位置。【结果】序列比对后发现OPD15940与重复序列Sukkula中近60个53bp的小片段有较高的同源性，但又不同于Sukkula，是一类新的重复序列。通过特异PCR确定仅含黑麦染色质的物种能扩增出OPD15940，因而OPD15940为黑麦所特有。原位杂交结果显示除端部区域外，pScD15940弥散状分布在黑麦整套染色体上。【结论】OPD15940可以作为分子标记检测导入到小麦背景中的黑麦染色体。     

利用小麦-黑麦1BL.1RS易位系快速筛选F2群体中携带抗条锈病基因Yr15的纯合个体

【目的】为了从F₂分离群体中快速鉴定含Yr15基因的纯合个体，从而减少后续选择的工作量。【方法】利用感条锈病的小麦-黑麦1BL.1RS易位系与含Yr15基因的小麦品系杂交，利用基于寡核苷酸探针Oligo-1RNOR的简便NDFISH方法对F₂群体进行鉴定。【结果】可以快速筛选出不含1BL.1RS易位染色体的植株，这些植株含1对1B染色体。因1BS不与1RS发生重组，所以它们都是含有Yr15基因的纯合个体，他们的自交后代不会出现抗感分离。【结论】这一方法可以提高Yr15的应用效率。对于其他小麦染色体携带的抗病基因，也可以采用这一方式，利用不同的小麦-黑麦易位染色体，从分离世代中快速鉴定出含抗病基因的纯合个体。该方法有利于加快小麦育种进程。     

偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用

【目的】偃麦草(Thinopyrum)是小麦(Triticum aestivum L.)的多年生野生近缘植物,具有许多可用于小麦品种改良的优异基因。利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系、绘制染色体指纹图谱及检测外源染色质。克隆十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum(Host)Liu and Wang)基因组特异重复序列,可用于鉴定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质。【方法】通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库,并对文库进行高密度点杂交(Dot-blot hybridization)筛选,结合荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术,获得偃麦草基因组特异的重复序列,分析其在不同基因组及染色体上的分布特点。利用Repeat Masker在小麦族重复序列数据库(Triticeae repeat sequence database,TREP)及NCBI Gen Bank对特异重复序列进行比对分析,并设计偃麦草基因组特异重复序列的PCR引物。通过FISH分析和特异PCR引物扩增,对小麦-偃麦草衍生后代进行鉴定和选择。【结果】获得7条偃麦草基因组特异的重复序列。FISH分析表明,其在十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布,且在不加小麦封阻DNA的情况下,能明确区分八倍体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体。将其应用到小麦-偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中,特异重复序列同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段,而且信号相比基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)更加特异和清晰。基于偃麦草基因组特异重复序列开发了90对引物,通过在中国春、十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析,筛选出36对(40%)偃麦草基因组特异PCR标记;利用这些特异引物对109份小麦-偃麦草衍生材料进行扫描,发现10对扩增效果较好的特异引物,其检测效率为73.3%—95%。【结论】获得偃麦草基因组特异的重复序列,开发了特异PCR扩增引物,可应用于小麦背景下偃麦草遗传物质的高效检测和跟踪。     

基于纤毛鹅观草特异的卫星重复序列开发寡核苷酸探针

[目的]本文旨在开发纤毛鹅观草特异的寡核苷酸（oligonucleotide, oligo）探针,进一步完善纤毛鹅观草染色体鉴定技术。[方法]利用前期选育的普通小麦-纤毛鹅观草异附加系DA2S^cL和DA6S^c,通过流式分拣和基因组二代测序获得纤毛鹅观草染色体6S^c和染色体臂2S^c长臂的基因组序列,利用Repeatexplorer2/TAREAN软件从中鉴定出卫星重复序列并设计成oligo探针,通过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）分析所开发oligo探针的应用价值。[结果]从6S^c和2S^cL基因组序列中共鉴定出11个卫星重复序列并开发成11个oligo探针,oligo-FISH结果表明,其中6个探针可以在纤毛鹅观草染色体上产生明显杂交信号,而在小麦染色体上未产生明显杂交信号,可用于特异鉴定小麦背景中的纤毛鹅观草染色体或片段。对1套普通小麦-纤毛鹅观草异附加系oligo-FISH分析发现,olig...     

拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型分析

【目的】建立拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型,分析明确不同来源拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型特点,比较不同拟斯卑尔脱山羊草及其与普通小麦的FISH核型差异。【方法】以荧光标记的寡核苷酸Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针,利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术分析pTa535和pSc119.2在不同拟斯卑尔脱山羊草、四倍体小麦和普通小麦染色体上的杂交信号分布特点;以禾本科植物着丝粒专化寡核苷酸Oligo-CCS1为探针,明确拟斯卑尔脱山羊草的着丝粒位置,测量拟斯卑尔脱山羊草染色体相关参数;通过FISH核型比较明确不同拟斯卑尔脱山羊草及其与小麦核型的多态性差异。【结果】Oligo-pTa535主要分布在小麦的D和A组染色体上,在小麦的B组染色体上仅有零星分布,在5份拟斯卑尔脱山羊草的染色体中未显示Oligo-pTa535杂交信号。Oligo-pSc119.2杂交信号主要分布在小麦的B组染色体上,在小麦的A、D组染色体中分布较少,但在5份拟斯卑尔脱山羊草染色体上均有广泛分布。根据Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2杂交信号在小麦染色体上的分布特点,可以将小麦的不同染色体相互区分开来。Oligo-pSc119.2杂交信号在不同倍性、不同品种的小麦B组染色体上的分布特点基本相似,而不同来源拟斯卑尔脱山羊草的Oligo-pSc119.2的FISH核型差异较大,甚至在同一细胞内的2条同源染色体上Oligo-pSc119.2杂交信号的分布也具有明显差异。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草与小麦B染色体组的FISH核型存在明显差异。PI542238的7对染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式为2n=14=14m。其余4份拟斯卑尔脱山羊草的4S染色体均为近中着丝粒染色体,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式皆为2n=14=12m+2sm。【结论】拟斯卑尔脱山羊草染色体上含有丰富的与pSc119.2高度同源的重复序列,不含有与pTa535高度同源的重复序列。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草之间以及同一来源的拟斯卑尔脱山羊草的个体间甚至同一个体内的同源染色体间在pSc119.2的分布上均具有遗传多样性。以Oligo-pSc119.2为探针建立的拟斯卑尔脱山羊草染色体FISH核型与小麦B组染色体的核型具有显著差异。利用荧光标记的Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针进行FISH分析,可以准确区分拟斯卑尔脱山羊草的不同染色体,并能将拟斯卑尔脱山羊草与小麦的染色体区分开来。     

小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂的变异

【目的】研究小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂的变异,为1BL.1RS在小麦育种中的进一步应用提供依据。【方法】利用GISH和FISH技术从小麦品种绵阳11(MY11)和白粒黑麦远缘杂交的后代中筛选1R(1B)代换系G1和1BL.1RS易位系G2。选用小麦染色体1B上的40对引物对亲本MY11、白粒黑麦、G1、G2以及普通小麦中国春(CS)进行SSR分析。【结果】6对引物在MY11、CS及G2中扩增出1BL的条带,在G1和白粒黑麦中未扩增出条带,其中3对引物(Xgwm259、Xbarc188,Xgwm268)在亲本MY11及后代1BL.1RS易位系(G2)中扩增出差异性的1BL条带,说明在小麦-黑麦远缘杂交产生的易位系后代中,1BL染色体臂发生变异。有13对引物在MY11、白粒黑麦和G1、G2中扩增出差异性条带,说明在小麦-黑麦远缘杂交后代中小麦微卫星发生了一定的变化;引物Xbarc8能扩增出白粒黑麦染色体1RS的特异条带,且该条带稳定出现,可以作为白粒黑麦1RS染色体识别和鉴定的分子标记。【结论】小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂发生变异,Xbarc8是鉴定白粒黑麦1RS染色体臂的新的分子标记。     

75K γ-黑麦碱基因的分子鉴定与转移

【目的】研究75K γ-黑麦碱基因的系统进化关系,并将秦岭黑麦75Kγ-黑麦碱基因导入普通小麦遗传背景中。【方法】利用75K γ-secalin亚基的特异引物secF/secR对5种黑麦进行扩增、克隆、测序及序列分析。以普通小麦(中国春)为母本,黑麦为父本,获得杂种。自杂种后代中,采SDS-PAGE技术分析杂交后代的75K γ-secalins蛋白亚基。用根尖制片进行体细胞染色体数目观察和原位杂交分析。【结果】序列分析结果表明,我国秦岭黑麦(AS156)与美国Wrens黑麦(CIse35)、土耳其4041黑麦(PI168199)、南非的Polko黑麦(PI412949)、智利278黑麦(PI436188)的栽培品系均具有75Kγ-黑麦碱典型的一级结构,但是在重复区中序列差异较大(包括缺失/插入和SNP)。聚类分析表明,我国的秦岭黑麦与同在北纬的土耳其和美国黑麦亲缘关系近,而与位于南纬的南非、智利的两种黑麦关系较远。以中国春为遗传背景,将位于秦岭黑麦2R染色体上的75Kγ-黑麦碱基因导入六倍体小麦,获得结实正常,农艺性状稳定的品系,编号WYQ122。通过SDS-PAGE技术和基因测序分析,已确认WYQ122中携带75Kγ-黑麦碱基因,同时原位杂交也验证黑麦染色体的存在。细胞学鉴定表明,WYQ122植株间染色体数目有41条和42条两种类型。【结论】黑麦的75Kγ-黑麦碱基因存在差异。以染色体代换系的方式将该基因转入普通小麦中。     

黑麦CenH3基因克隆及其在小麦1BL/1RS易位染色体中的定位

黑麦属蕴藏着丰富的遗传变异和改良小麦品质的优良基因,将其导入小麦能够拓宽小麦的遗传基础、丰富小麦的遗传变异。研究采用分子克隆技术获得黑麦CenH3基因的部分片段,并进行探针标记;同时,利用基因组原位杂交技术,筛选出32份1BL/1RS易位系;应用FISH技术,检测筛选出的32份1BL/1RS易位系,所有1BL/1RS易位系材料中均未发现黑麦CenH3基因的信号。但是,应用小麦和黑麦特异着丝粒DNA序列进行FISH检测,2个信号均出现在所有被检测的1BL/1RS易位系材料中。说明1BL/1RS易位染色体在不同小麦背景和山羊草属背景中均能稳定遗传,1RS的着丝粒DNA序列对1BS的着丝粒DNA序列有很好的补偿性,与小麦CenH3蛋白相互作用指导易位染色体正确分离且稳定遗传。