外源尿黑酸对拟南芥幼苗花青素生物合成的影响

以拟南芥Col–0(CK)和酪氨酸降解最后一步缺陷突变体sscd1为试验材料,采用外源尿黑酸处理幼苗,研究尿黑酸对花青素生物合成的影响。结果显示:外源尿黑酸能诱导拟南芥幼苗花青素的积累,而且在sscd1突变体中花青素的积累效果更显著;荧光定量PCR分析发现,尿黑酸处理能促进花青素生物合成基因(包括花青素生物合成的下游基因DFR、LDOX、UF3GT和上游基因PAL、CHI、CHS)的表达,且在sscd1突变体中,这些基因表达上调的幅度更大。以上结果表明,尿黑酸处理能激活花青素生物合成途径,从而促进花青素的积累;酪氨酸降解最后一步缺陷能促进尿黑酸诱导花青素的生物合成。     

苯丙氨酸处理对拟南芥酪氨酸降解途径的影响

以拟南芥野生型Col–0(CK)和酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1为试验材料,观察统计了4种浓度(0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)苯丙氨酸处理下种子萌发和幼苗生长情况,分析了苯丙氨酸对酪氨酸降解途径中关键基因HGO、MAAI和SSCD1表达的影响。结果发现:0.5、1.0、2.0 mmol/L苯丙氨酸处理能够抑制拟南芥种子的萌发和根的生长,对突变体sscd1的抑制程度高于野生型对照;0.1、0.5 mmol/L苯丙氨酸促进幼苗地上部分的生长,1.0、2.0 mmol/L苯丙氨酸抑制地上部生长,其中对突变体sscd1的抑制作用更为显著;q RT–PCR分析发现,苯丙氨酸处理能显著上调野生型中HGO基因的表达以及酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1中HGO和MAAI基因的表达,表明苯丙氨酸能上调拟南芥酪氨酸降解途径。     

色氨酸对拟南芥酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1细胞死亡的影响

为了解色氨酸处理是否影响sscd1的细胞死亡,以拟南芥野生型Columbia(Col–0)和sscd1突变体为试验材料,用色氨酸处理,观察并统计幼苗的死亡情况,检测叶绿素含量,分析酪氨酸降解途径基因HGO、MAAI和SSCD1以及活性氧诱导基因BAP1、OXI1、ZP的表达。结果表明：色氨酸处理能明显抑制sscd1突变体幼苗死亡,增加叶绿素的合成,抑制sscd1突变体中酪氨酸降解途径基因HGO和MAAI以及活性氧诱导基因BAP1、OXI1、ZP的上调。推测色氨酸可能通过增加叶绿素的生物合成,减少活性氧的产生来抑制酪氨酸降解途径突变体sscd1的细胞死亡。     

尿黑酸影响拟南芥酪氨酸降解缺陷突变体sscd1的种子萌发

[目的]探究外源添加尿黑酸对拟南芥酪氨酸降解途径的影响。[方法]以拟南芥野生型和酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1、hgo为材料,通过在培养基中添加不同浓度尿黑酸,分析长、短日照下对种子萌发的影响。[结果]在长、短日照下,外源添加0.1~0.4 mmol/L浓度尿黑酸推迟sscd1突变体种子萌发;外源添加0.8 mmol/L浓度尿黑酸抑制sscd1突变体种子萌发,而该浓度的尿黑酸对野生型和hgo突变体种子萌发没有影响。另外,在培养基中添加酪氨酸降解途径的异常代谢产物——琥珀酰丙酮,在长日照下也能抑制野生型种子萌发。[结论]尿黑酸处理后激活了酪氨酸降解途径,使sscd1突变体中积累较多的琥珀酰丙酮从而影响其种子萌发。     

拟南芥sscd1–1点突变对其表达的影响

为了探明拟南芥sscd1–1突变体中sscd1–1突变基因表达水平的降低是由剪切效率所致还是由自身启动子影响所致,分别构建了由外源35S启动子驱动的SSCD1正常基因和sscd1–1突变基因的表达载体及由内源自身启动子驱动的SSCD1正常基因和sscd1–1突变基因的表达载体,并将其转入到拟南芥sscd1–1突变体中。采用RT–PCR分析sscd1–1突变基因的表达。结果显示:外源35S启动子驱动的sscd1–1突变基因的表达与正常基因相比没有明显差别,而内源自身启动子驱动的sscd1–1突变基因的表达显著降低,这表明sscd1–1的点突变没有影响其剪切效率;sscd1–1突变基因表达水平的降低是由内源自身启动子影响所致。     

拟南芥psc1突变体降低蔗糖诱导的花青素积累

以拟南芥野生型和psc1突变体为材料,研究蔗糖(30、60、90、120、150 mmol/L)诱导花青素的积累.结果表明:蔗糖浓度高于60 mmol/L时,拟南芥psc1突变体中花青素的积累比野生型明显降低,花青素生物合成关键基因DFR的表达量减少.在无蔗糖和有蔗糖(90 mmol/L)条件下,添加表油菜素内酯进一步...     

不同糖对拟南芥种子萌发和sscd1突变体细胞死亡的影响

[目的]比较不同糖对拟南芥种子萌发以及sscd1突变体细胞死亡的影响。[方法]以拟南芥Col-0野生型和sscd1突变体为材料,在培养基中外源添加蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖,比较不同糖对拟南芥种子萌发和sscd1突变体细胞死亡的影响。[结果]在120 mmol/L浓度范围内,蔗糖、葡萄糖和果糖对拟南芥种子的萌发无显著影响,而麦芽糖对种子萌发有延迟作用,且糖浓度越高延迟作用越显著。120 mmol/L不同糖对sscd1突变体细胞死亡的抑制效果有显著差异,抑制效果由高到低依次为麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和果糖。[结论]该研究为深入研究糖代谢途径调控酪氨酸降解途径的机理提供理论依据。     

辣椒绿茎突变体gh1转录组及候选基因表达分析

以EMS诱变的辣椒绿茎突变体gh1和紫茎野生型樟树港辣椒(ST–8)为材料，测定茎中花青素含量；采用转录组测序技术(RNA–seq)和实时荧光定量PCR(qRT–PCR)分析与辣椒茎中花青素生物合成相关基因的表达水平。结果表明：突变体gh1茎中的花青素含量极显著低于ST–8茎中的花青素含量；与ST–8相比，gh1共获得1794个差异表达基因，包括1003个上调表达基因，791个下调表达基因；与花青素生物合成途径相关的基因包括9个结构基因(DFR、UF3GT、F3H、ANS、CHI、CHS、C4H、PAL、4CL)和3个转录因子(TT8、AN1、TTG1)；对与花青素合成相关的差异表达基因进行转录组表达量分析和qRT–PCR分析，筛选出4个结构基因(CHS、CHI、DFR、UF3GT)和1个转录因子(AN1)，推测这5个基因可能在辣椒茎中花青素生物合成途径中起重要作用。     

生长素参与三十烷醇诱导的拟南芥侧根发育

[目的]本文旨在研究植物生长调节剂三十烷醇对拟南芥侧根发育的影响,揭示其调控侧根发育的机制,为生产上的使用提供理论依据。[方法]以野生型拟南芥、生长素不敏感型突变体为试验材料,外源三十烷醇处理生长5 d的幼苗,分析侧根数目、侧根密度、侧根原基数量、侧根原基密度、细胞周期调控的关键基因的表达、根部内源IAA含量、生长素合成关键基因表达等指标。[结果]外源三十烷醇处理拟南芥的幼苗,能够诱导侧根的产生,0.2、0.5和1μmol·L-1三十烷醇处理8 d,侧根密度分别增加了59.0%、97.9%和54.2%;0.5μmol·L-1三十烷醇处理后A阶段的侧根原基密度增加了67.8%。外源三十烷醇处理增加根部吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)的含量,上调参与生长素合成的关键酶基因表达,增强根尖和不同发育阶段侧根生长素响应报告基因DR5:β-glucuronidase(GUS)和IAA2:GUS的表达。生长素运输抑制剂三碘苯甲酸(2,3,5-triiodobenzoic acid,TIBA)及萘基邻氨甲酰苯甲酸(1-naphthylphthalamic acid,NPA)和作用抑制剂p-chlorophenoxy isobutyric acid(PCIB)的添加抑制了三十烷醇诱导的侧根发育;生长素不敏感型突变体tir1-1和axr1-3对三十烷醇缺乏响应,而aux1-7和eir1-1对三十烷醇的响应弱于野生型。[结论]三十烷醇能够通过促进侧根原基的从头形成来增加侧根的密度,其诱导侧根发育依赖生长素的途径。     

拟南芥AtBT4对灰葡萄孢的抗性机制分析

【目的】揭示AtBT4在拟南芥抗灰葡萄孢中与SA、JA信号途经的相互关系。【方法】利用RT-PCR技术,检测用SA、SA类似物BTH、JA、ACC及灰葡萄孢处理拟南芥野生型Col-0后其AtBT4的表达情况;检测经SA和JA处理后拟南芥SA、JA途径相关突变体AtBT4的表达情况;并检测接种灰葡萄孢后拟南芥野生型Col-0、bt4突变体和回复突变体抗病相关基因的表达情况。【结果】JA处理和接种灰葡萄孢后,拟南芥野生型Col-0中AtBT4的表达明显增强。但经JA处理后,JA不敏感突变体jar1的AtBT4表达变化趋势与野生型明显不同,AtBT4的表达水平不受JA诱导。SA信号途径相关突变体eds5、sid2和npr1中AtBT4的表达明显低于野生型,但变化趋势与野生型基本一致。bt4突变体中抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达明显低于野生型和回复突变体。【结论】AtBT4的表达受JA和灰葡萄孢的诱导,AtBT4突变影响抗病相关基因PR1、PR4、PDF1.2和BIK1的表达,AtBT4可能通过SA、JA信号途径影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。     

不同颜色果袋对葡萄花青苷合成的调控

【目的】探明不同颜色果袋引起的光质差异对葡萄花青苷合成的影响,为葡萄专用果袋的研发提供理论依据。【方法】以5年生‘贝达’砧‘巨峰’葡萄为试材,于坐果后30 d分别套红色、绿色、蓝色和白色纸质果袋,以不套袋为对照,每8 d采样一次,直至果实成熟。利用光纤光谱仪分析不同纸袋的透射光谱,高效液相法测定果实发育过程中果皮花青苷含量变化,同时利用荧光定量PCR技术分析花青苷合成途径结构基因Vv CHS、VvLDOX、VvUFGT和调控基因VvmybA1以及光信号转录因子VvHY5的表达差异。【结果】红色纸袋、绿色纸袋和蓝色纸袋分别在红光、绿光和蓝光波段具有选择透过性,白色纸袋对光质的透过性没有选择性。不同颜色果袋对葡萄花青苷合成具有显著性影响,红色纸袋、绿色纸袋和蓝色纸袋处理明显推迟了葡萄的转色期,并延缓了花青苷的积累,但到果实完熟期,花青苷含量表现为蓝色纸袋白色纸袋对照绿色纸袋红色纸袋。基因表达分析表明,VvMYBA1、VvCHS、VvLDOX和VvUFGT表达量均表现为先升高后下降,与花青苷积累规律相一致;不同颜色果袋均延缓了花青苷合成调控基因VvMYBA1和结构基因VvCHS、VvLDOX、VvUFGT表达量在果实发育早期的升高和后期的下降,在表达高峰到来前,总体表现为对照和套白色纸袋表达量较高,其次是套蓝色纸袋,套绿色纸袋和套红色纸袋表达量较低;表达高峰之后总体表现为套蓝色纸袋和套白色纸袋表达量较高,其次是套绿色纸袋和套红色纸袋,对照表达量最低。VvHY5在果实成熟过程中在花青苷快速积累期和果实成熟后期有两次表达高峰,与花青苷的积累规律和合成调控基因VvMYBA1的表达规律基本一致,不同颜色果袋对VvHY5的诱导效应不同,蓝色纸袋诱导能力最强,红色纸袋效果最差。【结论】蓝色纸袋有利于葡萄花青苷合成,红色纸袋效果较差。不同颜色果袋对果实花青苷积累的调控可能是通过影响光信号转录因子VvHY5的表达,进而调控花青苷合成调控基因VvMYBA1和结构基因VvCHS、VvLDOX、VvUFGT等的表达,影响葡萄果皮花青苷的合成。     

苹果生长素响应因子MdARF5的克隆与功能鉴定

【目的】分离苹果生长素响应因子MdARF5（Auxin Response Factor 5）,分析其对生长素的响应,鉴定其在调节花青苷合成过程中的作用,揭示MdARF5的生物学功能,为进一步研究生长素对花青苷的调节提供理论依据。【方法】以‘嘎拉’苹果（Malus×domestica ‘Royal Gala’）为材料,利用同源克隆技术,克隆得到一个ARF（Auxin Response Factor）转录因子,并将其命名为MdARF5。利用MEGA5.0软件构建多物种间系统进化树。通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织花青苷积累的差异。利用烟草叶片瞬时转化试验,分析MdARF5对MdMYB1的转录调控。【结果】克隆获得苹果生长素响应因子MdARF5（序列号：MDP0000143749）,该基因CDS为2 691 bp,编码含有896个氨基酸的蛋白。系统进化树分析表明,苹果MdARF5与梨PbARF5同源性最高。基因表达分析显示,该基因响应生长素处理,并且与花青苷合成相关基因表现出相反的表达模式。在苹果愈伤组织中超表达MdARF5,其花青苷积累较野生型显著降低,表明MdARF5在调控花青苷积累过程中发挥重要作用。对苹果MdMYB1启动子序列进行分析,发现其序列包含一个MdARF5的结合位点。烟草瞬时表达试验显示,MdARF5能够抑制MdMYB1的表达。【结论】推测苹果MdARF5可能通过直接抑制MdMYB1的表达负调节花青苷的积累。     

转录组及代谢组联合解析茄子果色上位遗传效应

【目的】 茄子果色与商品果外观品质和价值密切相关,花青素是决定茄子果色的重要天然色素之一。通过基因表达和代谢物差异比较,解析上位基因互作调控茄子果皮花青素合成的作用机制,为不同果色茄子选育提供理论基础。【方法】 以花青素合成结构基因ANS突变的白果色母本19141、花青素合成关键调控基因MYB1突变的白果色父本19147及其紫红果色F₁代E3316茄子为试验材料,对商品果期果皮进行转录组测序和广靶代谢组分析。【结果】 转录组测序分析表明,19141_vs_19147的差异表达基因（DEGs）最多,其次是E3316_vs_19141,两个比较组DEGs均在类黄酮途径富集程度最高;E3316_vs_19147筛选到的DEGs最少,未在类黄酮途径富集。广靶代谢组共检测分析到218个代谢物。E3316_vs_19141共检测到差异代谢物（DAMs）113个,E3316_vs_19147共检测到差异代谢物98个。转录组和代谢组联合分析发现花青素生物合成关键结构基因CHS、CHI、F3H、DFR和ANS,关键调节基因MYB1、AN1和AN11,修饰基因3GT、5GT、AT和OMT,还有转运基因AN9（GST）相对表达量均为19141>E3316>19147;果皮呈色相关的花青素类代谢物矢车菊素（CAS：528-58-5）、矢车菊素3,5-二葡萄糖苷（CAS：20905-74-2）含量为E3316>19147>19141。上位基因调控下,茄子果皮中同时表达F3′H与F3′5′H,但是F3′H表达水平远高于F3′5′H。E3316花青素含量高于亲本,绿原酸含量低于其亲本。【结论】 上位性基因互作控制果色的遗传背景下,亲本突变基因类型决定了花青素代谢通路基因表达趋势和果皮呈色抑制方式。两个白果色亲本杂交F₁代果皮呈紫红色是由于花青素生物合成途径两个互作突变基因位点功能互补;F3′H高水平表达是合成矢车菊型花青素的主要原因;果皮花青素和绿原酸生物合成间存在竞争关系。     

Regulation of Anthocyanin during Storage Root Development Stage in Sweet Potato(Ipomoea batatas(L.) Lam.)

Anthocyanin accumulation during storage root development in purple-fleshed sweet potato was analyzed by detection of anthocyanin concentration, accumulation rate and the expression pattern of anthocyanin biosynthetic genes by semi-quantitative RT-PCR. Anthocyanin concentration in sweet potato cvs Jishu 18 and Ayamurasaki increased steadily during storage root development stage. The accumulation rate in two genotypes peaked at 50 to 65 d after transplanting, and then declined rapidly. During storage root development of Ayamurasaki, the anthocyanin biosynthesis gene, IbCHS, was constitutively expressed, the genes IbF3H, IbDFR, IbANS were induced steadily, reaching a maximum at the later stage of root thickening, and IbPAL steadily decreased. Therefore, the mechanism of anthocyanin accumulation differed between the two cultivars, and anthocyanin biosynthesis was regulated through regulation of its synthetic enzymes.     

观赏海棠叶片McmiR159a克隆及功能验证

【目的】为了验证观赏海棠叶片McmiR159a对花色苷代谢的调控作用。【方法】以观赏海棠红叶品种‘王族’为试验材料,确定McmiR159a前体基因序列并对其靶基因进行预测,构建McmiR159a过表达载体并瞬时转入‘王族’组培苗。其次通过高效液相色谱和qRT-PCR分析瞬时侵染植株中花色苷的含量及其合成途径中结构基因的表达量。【结果】结果表明,McmiR159a在观赏海棠中过表达下调其靶基因表达,上调花色苷代谢途径关键基因的表达,进而增加花色苷的含量。【结论】研究结果表明,观赏海棠中McmiR159a对花色苷的合成具有正调控作用。     

基于转录组分析ABA促进葡萄花青苷积累相关基因

【目的】分析参与调控ABA促进葡萄着色的相关基因,探讨ABA促进葡萄果实花青苷积累的分子机制。【方法】以‘红巴拉多’葡萄为试材,在转色前期（约花后6周）使用300 mg∙L^-1 ABA对果穗进行浸果处理,以清水处理为对照。观察表型,并利用超高液相色谱质谱联用仪（UPLC-MS）测定花青苷组分及含量,再利用转录组测序技术从分子水平对ABA促进花青苷积累的机制进行生物信息学分析。【结果】外源ABA处理3 d后,葡萄果实着色明显加深,花青苷种类和含量增多,其中芍药素3-O-葡萄糖苷、锦葵色素3-O-葡萄糖苷两种单体花青苷含量增加最为显著。分析ABA处理18 h和3 d后葡萄果实转录水平的差异,并通过KEGG富集分析发现了11个ABA信号通路基因以及52个与花青苷生物合成和转运相关的基因差异表达,它们均在外源ABA处理后表达上调。通过将差异基因与葡萄转录因子库进行比对,共发现297个转录因子差异表达。进一步分析差异转录因子表达模式,筛选与VvMYBA1表达模式相近的转录因子,发现15个MYB、bHLH、bZIP、NAC、Dof、HD-ZIP等家族的转录因子,其可能参与调控花青苷生物合成。启动子顺式作用元件分析表明,大部分筛选到的差异基因启动子中含有ABRE元件,说明这些差异表达基因的启动子可能为ABA诱导型启动子。对部分候选基因的表达模式进行实时荧光定量（qRT-PCR）分析,证实了RNA-seq的准确性。【结论】ABA促进葡萄花青苷积累涉及11个ABA信号转导、52个花青苷合成和转运相关基因,15个转录因子可能参与调控了这一生物过程。研究结果为揭示ABA促进葡萄花青苷积累的分子机制提供了一定基础。