稻瘟病菌Mofbox基因缺失突变体构建及生物学表型分析

采用啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)F-box蛋白的氨基酸序列对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)全基因组数据库进行Blastp分析,找到一个与之同源的、具有典型F-box结构域的蛋白编码基因,命名为Mofbox。采用同源重组原理,将构建的基因敲除载体转化稻瘟病菌,获得该基因缺失突变体2个。研究表明,在稻瘟病菌中,Mofbox缺失后可导致稻瘟病菌生长速率显著下降,分生孢子产孢量和附着胞形成率显著降低,对外源过氧化氢敏感,改变细胞壁完整性,同时降低对大麦和水稻敏感品种CO-39的致病性。     

稻瘟病菌Mofbox基因缺失突变体构建及生物学表型分析

采用啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)F-box蛋白的氨基酸序列对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）全基因组数据库进行Blastp分析,找到一个与之同源的、具有典型F-box结构域的蛋白编码基因,命名为Mofbox。采用同源重组原理,将构建的基因敲除载体转化稻瘟病菌,获得该基因缺失突变体2个。研究表明,在稻瘟病菌中,Mofbox缺失后可导致稻瘟病菌生长速率显著下降,分生孢子产孢量和附着胞形成率显著降低,对外源过氧化氢敏感,改变细胞壁完整性,同时降低对大麦和水稻敏感品种CO-39的致病性。     

利用细胞壁锚定蛋白MbA构建新型苏云金芽胞杆菌表面展示系统

从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)野生型菌株YBT-9602基因组中通过PCR扩增到编码一种具有细胞壁锚定活性的芽胞皮层水解酶的编码基因mbA。序列测定和编码产物结构域预测分析显示,mbA编码产物在结构上由1个具有肽聚糖结合性能的N-末端结构域和1个具细胞壁水解酶活性的C-末端结构域组成,具有作为细胞表面展示系统的运载蛋白的潜力。通过体外构建mbA与绿色荧光蛋白基因gfp的融合基因(mbA-gfp)并导入苏云金芽胞杆菌受体菌中进行表达,经对重组菌全细胞免疫荧光显微镜观测、蛋白酶pronase消化试验和SDS处理,证实GFP被成功展示于受体菌细胞表面;经流式细胞仪测定,以细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶为靶蛋白的表面展示系统有42.97%的重组菌细胞可展示融合酶,重组菌具有13.5U/mL的全细胞酶活性。结果表明,MbA作为一种细胞壁锚定蛋白可用于构建新的苏云金芽胞杆菌细胞表面展示系统。     

香蕉中抗病基因相似序列的克隆与分析

根据植物抗病基因编码氨基酸序列的核苷酸结合(nucleotide binding site,NBS)和富含亮氨酸重复区(leucine-rich repeat,LRR)等保守区域的特点,设计PCR简并引物,从香蕉华农7号中克隆得到1个1 139bp的DNA片段.BLAST分析发现,其编码的氨基酸序列与多种植物来源的NBS-LRR类抗病蛋白及抗病蛋白同源物的相似性为40%～50%,并具有NBS-LRR类抗性基因所拥有的保守结构域:P-环、激酶2a、激酶3a和疏水结构域等区段.该抗病基因相似片段可作为分子标记来筛选香蕉的抗病基因.     

克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的获取与序列分析

【目的】研究克雷伯氏菌果胶酸裂解酶基因K-PGL的序列特征及其编码产物的理化性质、结构特征及同源性等。【方法】根据同源序列相似性设计引物,利用PCR、染色体步移等技术获得了基因序列,并对基因信号肽,疏水性和结构域等进行了分析。【结果】获得克雷伯氏菌2395 bp序列,其中K-PGL基因开放阅读框1710 bp,编码569个氨基酸,分子质量63.37 kDa,等电点7.17。编码蛋白具有信号肽酶切割位点,效率为0.864,序列中不含有半胱氨酸Cys,平均疏水指数为-0.449,为稳定存在的亲水蛋白。基因编码的蛋白具有内切聚半乳糖醛酸裂解酶基因家族特有的保守结构域,进化上与产酸克雷伯氏菌亲缘关系最近。【结论】获得了K-PGL基因序列及其特征,为进一步研究果胶酸裂解酶的生物学功能和应用提供依据。     

拟南芥抗灰霉病相关基因的克隆与原核表达

为了从拟南芥中获得抗灰霉病相关基因以及进行基因分析,本试验利用RACE技术获得了该基因的cD-NA全长(1190 bp),并用生物信息学方法和Southern Blotting技术明确了该基因是编码372个氨基酸的转录调节/结合蛋白的AT5G67480基因,以单拷贝形式存在于拟南芥基因组中。编码的蛋白含有BTB/POZ结构域,体外诱导表达的蛋白对灰霉病菌的生长有一定的抑制作用。     

球孢白僵菌HsbA蛋白的原核表达及免疫定位

【目的】明确虫生真菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）疏水表面结合蛋白HsbA（hydrophobic surface binding protein A）的致病过程。【方法】对HsbA进行克隆、亚克隆和原核表达,根据纯化后的蛋白制备多克隆抗体并进行抗原性分析,利用免疫电镜对HsbA蛋白进行定位观察。【结果】原核表达系统成功诱导了白僵菌的HsbA融合蛋白,制备多克隆抗体经Western杂交分析表明,该多抗能特异性识别目的蛋白。免疫电镜结果显示,HsbA蛋白在孢子和菌丝中呈随机分布。正常生长状态下,菌丝中的HsbA蛋白数量要明显多于孢子中被标记的数目,此外,孢子在侵染状态和正常生长状态下的HsbA蛋白数量也有显著差异,侵染状态下孢子的HsbA蛋白表达量更高,但菌丝在这2种状态下均呈现高表达。感染虫体中HsbA蛋白被标记的部位集中在体壁。【结论】原核表达实现了HsbA蛋白的高效表达,且制备的多克隆抗体具有较好的免疫原性。此外,免疫定位表明HsbA蛋白与菌丝的生长有关,并在白僵菌致病过程中参与了吸附作用,其作用部位位于昆虫体壁。     

稻瘟病菌Subtilases家族生物信息学分析及其中一蛋白的分泌性检验

根据已有的研究结果推测稻瘟病菌Subtilases家族基因可能在其致病过程中具有重要的功能,本研究以进化理论为基础,结合一些生物信息学的软件对稻瘟病菌基因组中Subtilases家族基因进行了比较基因组、进化分析及功能域分析,分析了Subtilases家族对稻瘟病菌致病性的重要性,并推测家族中不同基因的结构、功能及参与的生理过程可能的异同之处,以基因MGG_07965.6为例,分析其可能具有的生物学功能,并通过实验的方法证实了其基因表达产物确是分泌蛋白。     

梨果黑斑病菌钙调磷酸酶基因生物信息学分析及其对侵染结构分化的调控作用

为揭示梨果黑斑病菌Alternaria alternata CaN基因的调控作用,采用RT-PCR技术克隆A.alternata CaN基因,利用在线工具对其基因及其编码蛋白进行生物信息学分析;同时分析其在A.alternata侵染结构分化过程中的表达特性;并进一步以钙调磷酸酶专一性抑制剂环孢菌素A(CsA)处理研究其对A.alternata侵染结构分化和致病性的影响。结果A.alternata克隆得到CNA和CNB基因,分别命名为AaCNA(GenBank NW＿017306222)和AaCNB(GenBank NW＿017306193),生物信息学分析表明AaCNA和AaCNB均无跨膜结构,且具有多个磷酸化位点,主要定位于细胞核上;AaCNA包括一个N端催化结构域、CNB结合结构域、钙调素CaM结合结构域和自抑制蛋白结构域,AaCNB具有4个EF-hand Ca²⁺结合位点。qRT-PCR分析表明,在疏水及果蜡诱导A.alternata侵染结构分化过程中AaCNA和AaCNB基因表达量均显著上调,且果蜡诱导作用更明显。药理学表明,环孢菌素A处理显著抑制疏水性和...     

一个假定的稻瘟病菌RhoGEF蛋白参与营养生长和产孢过程的调控

对稻瘟病菌致病机制的认识将有助于更好地防治水稻稻瘟病.在明确多个Rho族小G蛋白在该菌营养生长、分化孢子形成以及侵染致病过程中起到重要作用的基础上,进一步研究Rho族小G蛋白调控因子-鸟苷酸交换因子(GEF)的功能.以生物信息学和分子遗传学方法,研究了稻瘟病菌基因位点Mgg_11178.6所编码蛋白的功能.结果表明Mgg_11178.6编码一个假定的Rho族小G蛋白鸟苷酸交换因子(MoRGF1),与多种丝状子囊菌RhoGEF亲缘关系密切;基因敲除突变体表现为生长速度减慢,产孢量明显减少,但是致病力没有变化.说明该假定的Rho族小G蛋白鸟苷酸交换因子(MoRGF1)可能参与稻瘟病菌营养生长与产孢过程的调控.     

Rho蛋白家族在丛枝菌根真菌与植物共生关系建立中的功能分析

Rho家族蛋白是一类含有GTPase结构域的高度保守蛋白的总称,它是真核生物中Ras超家族主要成员之一。通过同源比对以及RACE等技术从丛枝菌根真菌（Rhizophagus irregularis）DAOM197198中分离到了3个Rho家族小G蛋白。通过与其他真菌Rho蛋白家族成员进行系统进化分析,结果表明,所分离到的RiCDC42,RiRac1,RiRho1属于高度保守的Rho蛋白家族成员;利用实时荧光定量PCR方法对这3个基因在前共生阶段和共生阶段的表达模式进行分析,结果发现RiRho1在萌发孢子中的表达量最高,而在共生时期表达下调,RiRac1和RiCDC42基因在共生时期的表达量比共生前期高。此外,本研究还利用酵母CDC42,Rho1温度敏感性突变株,稻瘟病菌ΔMgCDC42突变株以及HIGS技术对Rhizophagus irregularis Rho蛋白家族成员进行进一步研究。结果显示,RiRho1与RiCDC42基因能够互补酵母Rho1与CDC42温度敏感型表型;对RiCDC42与RiRac1进行HIGS时,Rhizophagus irregularis 丛枝发生明显的降解;RiCDC42基因能够互补稻瘟病菌ΔMgCDC42突变体部分表型,但不同的是互补菌株不产黑色素。由此推测Rho蛋白家族成员可能在丛枝菌根真菌共生关系建立的过程中具有重要的作用。     

Comparative analysis of the genome of the field isolate V86010 of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae from Philippines

Genome dynamics of pathogenic organisms are driven by plant host and pathogenic organism co-evolution,in which pathogen genomes are used to overcome stresses imposed by hosts with various genetic backgrounds through generation of a range of field isolates. This model also applies to the rice host and its fungal pathogen Magnaporthe oryzae. To better understand genetic variation of M. oryzae in nature,the field isolate V86010 from the Philippines was sequenced and analyzed. Genome annotation found that the assembled V86010 genome was composed of 1 931 scaffolds with a combined length of 38.9 Mb. The average GC ratio is 51.3% and repetitive elements constitute 5.1% of the genome. A total of 11 857 genes including 616 effector protein genes were predicted using a combined analysis pipeline. All predicted genes and effector protein genes of isolate V86010 distribute on the eight chromosomes when aligned with the assembled genome of isolate 70-15. Effector protein genes are located disproportionately at several chromosomal ends. The Pot2 elements are abundant in V86010. Seven V86010-specific effector proteins were found to suppress programmed cell death induced by BAX in tobacco leaves using an Agrobacterium-mediated transient assay. Our results may provide useful information for further study of the molecular and genomic dynamics in the evolution of M. oryzae and rice host interactions,and for characterizing novel effectors and AVR genes in the rice blast pathogen.     

低温条件下日本医蛭各组织基因表达转录组测序及qPCR验证

为解析日本医蛭(Hirudo nippnica Whitman)繁殖的分子机理,研究不同温度下饲养的日本医蛭各组织基因表达差异情况。利用转录组学测序检测不同温度饲养条件下日本医蛭肌肉、环带和头部组织的基因表达情况,筛选出11个差异表达基因,并对其进行qPCR验证。qPCR结果显示一种具有去饱和酶功能的膜蛋白编码基因G6,在日本医蛭环带中的表达随温度的升高而降低,与转录测序结果一致,暗示G6基因可能为日本医蛭繁殖相关的关键基因。进一步对G6蛋白进行功能域预测,结果显示其属于一种跨膜蛋白。其他10个差异表达基因的转录组测序结果和qPCR结果基本保持一致,通过蛋白功能域预测结果显示预测出假定蛋白均含有的功能结构域;通过miRNA亲和预测,非编码RNA(G13)具有高亲和miRNAs特性。研究发现了10个潜在的功能基因和一个非编码RNA基因。     

基于盐胁迫转录组信息的蚕豆F-box基因家族分析

【目的】通过生物信息学方法分析蚕豆F-box基因家族成员的分布、结构及进化,研究家族成员在不同处理时间条件下的表达模式及对盐胁迫的响应,为该类基因生物学功能和盐胁迫机制的研究提供参考。【方法】基于蚕豆盐胁迫转录组测序（RNA-seq）数据,利用NR、Swiss-prot和PFAM 3个数据库和NCBI网站,对蚕豆F-box基因进行筛选注释;利用Web Logo 3、Prot Comp 9.0、MEGA-X和MEME等软件进行保守结构域、亚细胞定位、系统进化树和Motif等生物信息学分析。基于盐胁迫转录组数据分析蚕豆（yz17134耐盐和yz17078不耐盐）F-box基因家族在盐胁迫下的差异表达模式,并采用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测部分家族成员在16和24 h的表达情况。【结果】基于盐胁迫转录组测序数据,注释得到161个蚕豆F-box基因,均含有F-box保守结构域。根据C端结构域的不同,将其分成11个亚族：FBX、FBXFBA、FBXLRR、FBXPP2、FBXKelch、FBXTUB、FBXFBD、FBXDUF、FBXACTIN、FBXWD40和FBO。保守结构域分析表明,F-box保守基序中包含1个极度保守的色氨酸残基。比较分析蚕豆F-box家族和拟南芥F-box家族共同构建的进化树,发现同一C端结构域的基因大多聚集在一起。亚细胞定位预测结果显示,124个F-box基因定位于细胞外,37个定位于细胞核中。基因结构分析表明,蚕豆F-box家族基因的DNA序列中均无内含子,且均由UTR区和CDS区组成。基于盐胁迫转录组数据的F-box差异表达模式分析表明,蚕豆F-box基因在2个不同处理时间点上的表达各不相同,在盐处理16 h的表达较为明显。qRT-PCR分析结果表明,在F-box家族成员中,共存在5个差异基因。其中Vf056266.1、Vf062764.1和Vf024236.1在盐处理16 h的表达量均上调,Vf060904.1和Vf045761.1在盐处理16 h的表达量均下调。【结论】蚕豆F-box基因家族注释得到161个蚕豆F-box基因,分为11个亚族。其中5个重要的F-box基因在不同盐处理时间的表达量存在差异。     

家蚕核多角体病毒p10基因的克隆和分子系统进化分析

根据GenBank中家蚕核多角体病毒T3株中p10基因的保守序列,克隆得到了8个不同地区的家蚕核多角体病毒的p10基因,并分别与GenBank中的NPVp10基因进行比对.结果发现p10基因都含有1个213 bp的开放阅读框(ORF)共编码70个氨基酸,8株P10蛋白间氨基酸序列相似性为95%~100%,相似性高.与GenBank中Ac-MNPV和BmNPV的P10蛋白相比,8株BmNPV P10蛋白都缺失了3个保守结构域中的C-端结构域,只含有2个保守结构域,即N-端卷曲螺旋和Pro丰富区.     

飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析

 【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。     

南繁区稻瘟病菌无毒基因的检测

为明确南繁区稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)无毒基因的分布情况,对6个无毒基因(ACEI、Avr-Pia、Avr-Pik、Avr-Pita、Avr-Piz-t和PWL2)在南繁核心区和非核心区60个稻瘟病菌菌株中的分布情况进行PCR检测。结果发现,这6个无毒基因在核心区和非核心区的检出率分别为100.00%和96.67%、33.33%和0.00%、100.00%和100.00%、96.67%和90.00%、73.33%和100.00%以及100.00%和73.33%。该结果说明除了无毒基因Avr-Pia在南繁非核心区的稻瘟病菌中未检测到外,其余无毒基因在2个区域的稻瘟病菌中均存在,其中无毒基因Avr-Pik在2个区域的稻瘟病菌中分布率最高,均为100%,其他无毒基因在2个区域的稻瘟病菌中表现出一定的分布率差异。     

大白菜GH3基因家族全基因组鉴定及表达分析

生长素酰胺合成酶（GH3）基因家族是生长素早期应答基因家族之一，在植物生长素信号转导过程中发挥重要作用。基于大白菜全基因组数据对大白菜GH3家族进行全基因组鉴定及生物信息学分析，结果表明，在大白菜基因组中共鉴定到45个包含GH3结构域的BrGH3家族成员；BrGH3家族成员编码氨基酸数在286～826之间，分子量介于32.06～90.77 KD之间；系统进化分析将BrGH3家族分为4类；基因结构分析发现该家族成员外显子数为2～10个；蛋白保守基序（motif）分析表明，除了BrGH3.2和BrGH3.18外，BrGH3家族成员都含有10个Motif;41个BrGH3成员在10条染色体上均有分布，4个基因未定位到染色体上；共线性分析发现29个基因参与片段复制事件，存在5个串联重复；启动子顺式作用元件分析表明，BrGH3成员含有大量光、激素、逆境和生长发育等响应元件。基于大白菜结球野生型和不结球平塌突变体结球前期叶片不同部位转录组数据，分析BrGH3差异表达，结果表明，其中BrGH3.28和BrGH3.41基因在大白菜突变体叶片不同部位的FPKM值均高于野生型，为野生型的1.22～4.83倍，且BrGH3基因家族在LF亚基因组中优势表达，初步推测BrGH3基因家族成员参与调控大白菜叶球发育。本研究为进一步研究BrGH3基因家族的功能和大白菜叶球发育机理提供参考。