鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究

1材料与方法 1．1材料 供试鲤鱼购自成都市洗面桥市场。主要试剂：TR—Iaol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司，反转录试剂盒、pMD-18T载体、D12000DNA和如DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司；DEPC原液（Sigma分装）、JM-109感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司，其他试剂均为国产分析纯。     

雄性育性基因RNA干扰载体的构建与鉴定

1材料与方法1．1材料酶和试剂：各种限制性内切酶购自Roche公司，T4DNA连接酶购自上海生工公司，Taq聚合酶、dNTP、凝胶回收试剂盒均购自Promega公司，引物由上海生工公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯。植物材料和质粒：棉花洞A雄性可育株由西南大学棉花教研室提供，表达载体P^BП21质粒和大肠杆菌菌株XL1-Blue由西南大学生物技术中心实验室保存。pUCm-T克隆载体购自上海生工公司。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450CYP30581V1基因的诱导表达特征研究

1材料与方法 1．1材料与试剂野桑蚕采自苏州大学独墅湖校区桑园；宿主菌E．coli TOP10为苏州大学基础医学及生物科学学院生物资源与功能基因组学研究室保存；植物次生性物质芸香苷和内源性物质蜕皮激素均购自SIGMA公司；氯氰菊酯购自拜耳杭州作物科学有限公司；外源性化合物NaF（分析纯）购自西安化学试剂厂；RNAiso reagent试剂盒购自TakaRa公司；其他常用试剂购自TaKaRa公司或上海生工生物工程技术服务有限公司：     

外源蛋白定位马铃薯淀粉粒表达载体的构建

1材料与方法 1．1材料马铃薯品系：郑1011。受体菌：大肠杆菌BL21。载体质粒pCambia1305—1购自TaKaRa公司；反转录试剂、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒Wizard PCR preps DNA Purification System购自Promega公司。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

1材料与方法1．1表达菌及试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）6P-1-GP5表达质粒由该实验室保存。Novagen蛋白纯化试剂盒、硝酸纤维素膜（NC膜）均购自华美公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；辣根酶标记兔抗猪IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；其他常规试剂均由国内生产。试验用豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供，体重400-500g，共8只。     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

1材料与方法 1．1材料限制性核酸内切酶HindIII、BamHI、PvuII、SspI、质粒抽提试剂盒、EcoT14 DNAMarker购自TakaRa公司。T4DNA连接酶购于promega公司。大肠杆菌DH5α菌株由该实验室保存。siRNA表达载体pSilencer 4．1-CMV Nero质粒购自Ambion公司。     

一种高效提取棉花细胞核的技术

1材料与方法1．1材料二倍体亚洲棉品种石系亚1号，来自中国农业科学院棉花研究所。试剂HEPES购自Amresco公司，DTY购自BioBasicInc．，TritonX-100、PVP40购自Sigma公司，DAPI购自Roche公司，其他试剂均为国产分析纯。     

农杆菌介导油菜油体基因与碱性成纤维细胞生长因子融合基因转化油菜研究

1材料与方法 1．1材料 1．1．1供试材料。白菜型油菜苏州青，市售。 1．1．2菌株及质粒。采用根癌农杆菌LBA4404，该菌株含有植物双元表达载体pCAMBIA1390，油菜油体基因与bFGF的融合基因已整合到该载体上，该融合基因由油菜油体基因启动子启动。植物基因组提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，Southern检测试剂盒为DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，购于Roche公司。     

E．tenella吉林株单卵囊的分离及PCR鉴定

1材料与方法1．1材料①试验动物。1日龄海兰公雏，购自长春市北方鸡场。饲养于150℃，消毒1h的隔离器中，自由采食和饮水。饲喂不添加任何抗球虫药的全价饲料，喂前80℃高温消毒30min。②试验虫种。单卵囊分离用虫种，为该实验室从球虫严重临床发病鸡盲肠中分离。③试剂。基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司，D12000及PCR相关试剂购自大连宝生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯。④仪器。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

1材料与方法 1．1病毒来源鹅副粘病毒分离株GX1株由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存。 1．2试剂及仪器各种PCR反应试剂、PMD-18T载体、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购自宝生物工程（大连）公司。仪器：恒温孵化箱、PCR反应仪、超速离心机、移液器等。     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

[目的]克隆五指山小型猪生长激素释放激素（GHRH）受体基因的cDNA，并对其进行序列分析。[方法]以五指山小型猪耳组织提取的基因纽RNA为模板，根据已报道的猪GHRHRcDNA序列设计3对引物，用RT—PCR方法进行cDNA扩增。PCR产物经回收纯化后，与pMD18-T连接并转化大肠杆菌DH5a，转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆，阳性克隆经LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了五指山小型猪GHRH受体基因的cDNA，该片段长1577bp，编码423个氨基酸。BLAST分析结果表明，该片段与猪GHRH受体基因仅有23个碱基的差异，同源性为98％；而两者GHRH受体基因均由423个氨基酸组成，序列同源性为96％。[结论]该研究为进一步揭示五指山小型猪的矮小机理提供了理论依据。     

海南五指山猪SLA-DQA基因cDNA全长的克隆分析

[目的]为猪异种器官移植的免疫识别机理的研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增五指山猪DQA基因cDNA,然后进行测序和序列分析。[结果]海南五指山猪SLA-DQA基因序列长度为768个核苷酸,其中1～765为完全阅读框编码255个氨基酸残基。五指山猪SLA-DQA基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列与我国小型猪同源性最高,与人相应基因的同源性明显高于与小鼠的同源性。[结论]将五指山猪作为适合于进行异种器官移植的中国猪种,对免疫遗传学特性系列研究具有重要意义。     

五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。     

驴生长激素基因的克隆与分析

 【目的】克隆驴生长激素基因DNA和cDNA的全序列,分析其序列和cDNA编码的蛋白序列特征及其在不同物种中的遗传差异。【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果设计引物,应用RT-PCR和PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的DNA和cDNA及推定的氨基酸序列进行分析。【结果】从驴肝组织和血液中分别得到驴GH基因全序列1 928 bp和包括完整的编码区的cDNA序列706 bp,两者序列比对后证明驴GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽。序列比较结果表明,驴GH基因的序列与马同源性最高,启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而是CATA盒,该基因在进化过程中是保守的。【结论】从驴肝组织和血液中克隆了GH基因DNA和cDNA,DNA序列在1 267位的C→G可能影响到驴和马生长发育的差异,为下一步驴GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

蕨麻猪生长激素基因的克隆及多态性分析

[目的]探索蕨麻猪生长激素基因与其生理学和生物学特性的关系。[方法]从蕨麻猪血液细胞中提取基因组DNA,通过PCR技术扩增出蕨麻猪生长激素基因序列,进行碱基组成多态性和突变分析。[结果]蕨麻猪生长激素（pGH）基因序列全长1671bp,有5个外显子和4个内含子。外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10、161、117、162和201bp,内含子1、2、3和4的碱基数分别是244、210、192和277bp。除第1外显子和第1内含子碱基剪切有明显的例外,其余全部符合GT-AG规则;蕨麻猪生长激素基因4种碱基含量依次为G〉C〉T〉A。（G＋C）含量和（A＋T）含量分别在62%和37%以上。蕨麻猪编码区第4外显子在＋1046位处A→G,为错义突变,其余均为同义突变。蕨麻猪生长激素基因编码的前体蛋白含216个氨基酸,成熟蛋白是由190个氨基酸残基组成的一个分泌性蛋白;二级结构中含有6个α螺旋结构,三级结构是结构松散的球状蛋白,含有6个α螺旋前区。[结论]为蕨麻猪生长激素基因序列的研究提供了参考依据和借鉴。     

三元杂交猪IL-18全基因的序列测定及分析

白细胞介素-18（IL-18）又称γ干扰素诱导因子（IGIF），研究表明IL-18是一种重要的新型免疫佐剂分子。为探讨猪IL-18的免疫佐剂作用，该研究根据已发表的猪IL-18基因序列，设计并合成1对特异性引物，从猪脾脏中直接扩增得到猪IL-18全基因，并进行克隆和序列测定、分析。     

广西水牛ghrelin cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆广西水牛ghrelin的cDNA并对其进行序列分析。[方法]以广西沼泽型水牛的真胃底组织总RNA为模板，用特异性引物扩增ghrelin的cDNA。扩增产物经凝胶回收纯化后与pMD 18-T连接并转化大肠杆菌DH5d，转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆，阳性克隆经5×1ml LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了广西水牛ghrelin的cDNA，该片段长339bp，编码113个氨基酸。BLAST分析结果表明，该片段与黄牛前原ghrelin基因仅有6个碱基的差异，同源性为98．2％；而两者ghrelin均由27个氨基酸组成，序列同源性为1013％。[结论]为进一步研究ghrelin基因的生物学功能提了供理论基础。     

革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

[目的]构建革胡子鲶生长激素基因原核表达体系。[方法]采用PCR方法,扩增得到了革胡子鲶生长激素基因成熟肽的cDNA序列,将该序列克隆至原核表达载体pRSET-A,构建重组质粒pRSET-mGH,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达。[结果]革胡子鲶生长激素成熟肽cDNA序列全长534 bp,编码1个由178个氨基酸残基组成的生长激素成熟肽,分子量为20.28 kDa,等电点为5.93。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的目的融合蛋白分子量为27.41 kDa,主要以非可溶性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。目的融合蛋白的表达量高达细菌沉淀蛋白总量的36.8%。[结论]该研究为革胡子鲶生长激素的产业化开发和应用奠定了基础。