PDE3与亮甲酚蓝在绵羊卵母细胞体外培养中的应用研究(英文)

[目的]探讨磷酸二酯酶3(PDE3)特异性抑制剂Milrinone与亮甲酚蓝染色液(BCB)相结合在绵羊卵母细胞体外培养中的应用。[方法]比较了BCB对绵羊卵母细胞的筛选与传统的形态分级之间的差异,以及对胚胎后期发育的影响;研究了Milrinone对绵羊卵母细胞的最佳抑制时间,并用于BCB-卵母细胞体外培养。[结果]A、B级卵母细胞中BCB+卵母细胞的比例为64.42%,极显著高于C级卵母细胞的17.00%; BCB+卵母细胞的成熟率(86.16%)、卵裂率(85.29%)、囊胚率(34.40%)分别极显著高于BCB-卵母细胞(50.94%、36.19%和6.73%);6 h是Milrinone对绵羊卵母细胞的最佳抑制时间,该试验组体外培养效率显著高于其他组;Milrinone对BCB-卵母细胞抑制培养6 h,极显著提高了体外胚胎发育率。[结论]为提高绵羊卵母细胞体外培养效率提供了依据。     

亮甲酚蓝染色对水牛卵母细胞体外受精和孤雌激活胚胎发育的影响

[目的]探讨亮甲酚蓝（BCB）染色对水牛卵母细胞体外受精及孤雌激活胚胎发育的影响。[方法]卵丘卵母细胞复合体（COCs）在体外成熟培养前用浓度26μmol/L的亮甲酚蓝染色90 min,然后根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性（BCB＋,蓝色）和阴性组（BCB-,不着色）。以未经染色处理的COCs为对照组,控制对照组卵母细胞在含0.4%牛血清白蛋白（BSA）的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中孵育90 min。体外成熟培养后统计各组的成熟率、体外受精和孤雌激活后的发育率。[结果]BCB＋组的成熟率（65.70%）显著高于对照组（59.86%）、控制对照组（58.42%）和BCB-组（48.86%）。在体外受精后的囊胚发育率方面,BCB＋组（27.08%）和对照组（25.49%）差异不显著,但显著高于控制对照组（20.50%）和BCB-组（8.45%）。在孤雌激活后的囊胚发育率方面,BCB-组显著低于其他各组,但BCB＋组、对照组以及控制对照组之间无显著差异。[结论]亮甲酚蓝染色筛选出的阳性卵母细胞具有较好的核成熟发育潜能,但并不能显著提高卵母细胞体外受精及孤雌激活后的胚胎发育率。     

亮甲酚蓝筛选对广西巴马小型猪孤雌激活及克隆重构胚早期发育的影响

[目的]探讨亮甲酚蓝(BCB)染色是否可以筛选出发育潜能优秀的卵母细胞.[方法]猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)在体外成熟培养前用13μmol/L BCB染色,根据卵母细胞胞质蓝色的有无分为阳性(BCB+,蓝色)和阴性组(BCB-,不着色),以在不含BCB的改良杜氏磷酸盐缓冲液(m-DPBS)中处理90 min为控制对照组,直接培育作空白对照,体外成熟培养后统计各组卵母细胞的核成熟率及孤雌激活胚胎、克隆重构胚胎(供体细胞来自广西巴马小型猪)的早期发育率.[结果]BCB+组卵母细胞的核成熟率(80.8%)显著高于BCB-组(44.2%)和空白对照组(72.4%);BCB+组的孤雌囊胚形成率(32.9%)显著高于BCB-组(10.1%),但与对照组(25.8%)之间无显著差异;BCB+组显微操作核移植胚胎的囊胚发育率(14.1%)显著高于BCB-组(3.4%),但与对照组之间无显著差异;各组手工克隆胚胎发育率之间无显著差异.[结论]BCB染色筛选出的卵母细胞具有较好的核成熟发育潜能,但未能显著改善广西巴马小型猪显微操作及手工克隆胚胎的早期发育.     

BCB染色液对绵羊不同直径卵泡卵母细胞的筛选作用

为探讨亮甲酚蓝(BCB)染色液对绵羊不同直径卵泡卵母细胞的筛选作用,对筛选后的卵母细胞进行孤雌激活,统计不同组间成熟率、卵裂率及囊胚率的差异。将卵泡直径分为2mm、2~5mm、5mm共3组,经26μmol/L的BCB染色90min后,结果显示:(1)直径5mm卵泡中的卵母细胞阳性率极显著高于5mm以下卵泡组(P0.01);(2)卵泡直径5mm中BCB+组卵母细胞孤雌激活后的体外培养效率显著高于其余2组;(3)不同试验组卵母细胞孤雌激活后获得的囊胚总细胞数在BCB+组卵母细胞中,直径2~5mm组与5mm组间没有显著差异(P0.05),但极显著高于直径2mm组(P0.01);BCB-卵母细胞在各组间没有显著差异(P0.05);未经染色的卵母细胞中,直径2~5mm组与5mm组间没有显著差异(P0.05),但显著高于直径2mm组(P0.05);此外,2mm的卵母细胞,BCB+组极显著高于对照组和BCB-组(P0.01),在直径2~5mm组和5mm组,BCB+组、对照组和BCB-组均差异极显著(P0.01)。以上结果说明,直径2mm以上卵泡的卵母细胞用BCB染色液筛选后更适合体外培养。     

猪卵母细胞体外成熟研究

[目的]探讨猪卵母细胞体外成熟的最佳培养条件。[方法]以NCSU-23为基础培养基,研究不同激素组合和培养时间（36、40、44和48 h）对猪卵母细胞体外成熟的影响。[结果]猪卵母细胞体外培养44 h后,成熟率最高,为81.4%;猪卵母细胞在成熟培养液培养22h后,再在无激素培养液中继续培养22 h时,成熟率最高;添加性腺激素的组成熟率显著高于不添加组,差异显著（P〈0.05）。[结论]在体外成熟培养过程中,添加性腺激素能显著提高猪卵母细胞成熟率。     

卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响

[目的]为绵羊克隆试验中卵母细胞的体外成熟及去核时间提供参考。[方法]利用盲吸法结合荧光显微镜检查,对绵羊不同成熟时间卵母细胞去核的效率及其后续重构胚的发育进行对比。[结果]体外成熟培养19~21 h的绵羊卵母细胞在成熟率上显著高于体外成熟培养16~18 h(P(0.05),在去核成功率上显著高于体外成熟培养22~24 h(P(0.05);3个试验组在卵裂率、囊胚率上差异不显著(P(0.05),但是体外成熟培养19~21 h的试验组囊胚平均细胞数要显著高于其他2组(P(0.05)。[结论]体外成熟培养19~21 h的卵母细胞较适于作为受体细胞进行绵羊核移植,可以显著提高囊胚的质量。     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

透明质酸对绵羊卵母细胞体外成熟与早期胚胎发育的影响

[目的]探讨不同浓度透明质酸对绵羊卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育效果的影响。[方法]以绵羊卵母细胞为试验材料,分别在绵羊卵母细胞体外成熟和体外胚胎培养液中添加0、1.5、3.0、4.5 mg/ml的透明质酸（HA）,研究其对绵羊卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。[结果]当HA浓度为1.5和3.0 mg/ml时,绵羊卵母细胞的成熟率分别为72.54%和62.17%,显著高于对照（P〈0.05）。当HA浓度介于1.5～3.0 mg/ml时,HA对绵羊卵母细胞体外成熟有促进作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,绵羊卵母细胞的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组与其他组（P〈0.05）,囊胚细胞总数显著高于其他各组（P〈0.05）。这说明HA可以促进绵羊卵母细胞的早期胚胎发育。[结论]HA不仅可以促进绵羊卵母细胞成熟,而且在细胞分化中也会起作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,最有利于绵羊的早期胚胎发育。     

磷酸二酯酶亚型抑制剂与细胞周期蛋白抑制剂对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

选用磷酸二酯酶3（PDE3）特异性抑制剂Milrinone和PDE4特异性抑制剂Rolipram以及细胞周期蛋白依赖性激酶（cdk）抑制剂Roscovitine（ROSC）对绵羊卵丘卵母细胞复合物（COCs）的体外自发成熟进行研究，拟建立一种模拟体内卵泡环境的绵羊卵母细胞体外培养模型。以M-199为基础培养液，绵羊COGs在含有50μmol／L的Milrinone、Rolipram、ROSC或不含上述任何抑制剂的培养液中分别培养24h。COCs在含有50μmol／LROSC的培养液中培养24h，转移到含有20IU／L FSH的培养液继续培养24h检查核相。结果表明：COGs在M-199基础培养液和含有Rolipram的培养液中都可以自发恢复减数分裂，但是在含有Milrinone或ROSC的培养液中减数分裂受到阻滞；并且ROSC对绵羊COCs体外自发成熟的抑制作用要远高于Milrinone（P〈0．05）。当COGs从ROSC转移到含有20Iu／LFSH的培养液继续培养24h后．90．4％卵母细胞恢复到第2次减数分裂中期（MⅡ）。上述结果表明PDE3和cdk在绵羊减数分裂恢复中具有重要的作用。     

不同培养体系对牛卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨适合于牛卵母细胞体外受精以及受精卵体外培养的最佳培养体系。[方法]通过对成熟的牛卵母细胞分别采用传统培养体系（对照组）和过渡培养体系（试验组）进行体外受精和受精卵体外培养,研究了不同组合的培养体系对受精率和卵裂率的影响。[结果]以受精液为TALP液,受精卵培养液为60%TALP液＋40%M-199液＋5%FCS的过渡培养体系能够提高牛体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率,分别为77.8%和55.6%。[结论]受精液为TALP液,受精卵培养液为60%TALP液＋40%M-199液＋5%FCS的过渡培养体系为牛卵母细胞体外受精以及受精卵体外培养的最佳培养体系。     

磷酸二酯酶抑制剂对水牛卵母细胞体外成熟的影响

[目的]探讨磷酸二酯酶抑制剂米力农(milrinone)对水牛卵母细胞成熟的影响。[方法]水牛卵母细胞分成3组,分别在含0、50、100μmol/L的milrinone的成熟液中培养16 h后,每组的一半卵母细胞用来染色,检验核成熟情况;另一半卵母细胞再在不含milrinone的成熟液中培养12 h,挑选形态正常的卵母细胞受精后培养。[结果]添加50和100μmol/L milrinone的成熟液成熟的卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)比率分别为25.9%和12.1%,显著低于对照组(76.9%);但另一半卵母细胞再培养、受精后试验组(50、100μmol/L mil-rinone)的分裂率(59.3%和61.2%)和囊胚率(35.9%和31.1%)与对照组(56.7%和28.8%)相比均无显著性差异(P0.05)。[结论]milrinone对水牛卵母细胞的成熟具有明显的抑制作用,成熟抑制解除后水牛卵母细胞仍可保持较高的发育潜能。     

卵母细胞体外成熟时间对绵羊核移植效率的影响(英文)

[Objective] The study aimed to provide references for the time of oocyte maturation in vitro and enucleation in the course of sheep nuclear transfer(NT).[Method] Compared the effects of different maturation time of oocytes on enucleation efficiency and reconstructed embryo development by means of blind enucleation and fluorescence microscopy.[Result] Treatment of IVM(in vitro maturation)19-21 h was significantly higher than IVM 16-18 h treatment in oocyte maturation rate(P<0.05)and was significantly higher than IVM 22-24 h treatment in enucleation rate(P<0.05).Three treatments had no significant difference in cleavage rate and blastocyst rate(P>0.05),but IVM 19-21 h treatment was significantly higher than the other 2 treatments in average cell number of blastocysts(P<0.05).[Conclusion] The appropriate in vitro maturation time of oocytes was 19-21 h for sheep nuclear transfer,which could significantly improve the quality of blastocysts according to the cell number per blastocyst(P<0.05).     

Effects of in Vitro Maturation Time of Oocytes on Sheep Nuclear Transfer Efficiency

[Objective] The study aimed to provide references for the time of oocyte maturation in vitro and enucleation in the course of sheep nuclear transfer(NT).[Method] Compared the effects of different maturation time of oocytes on enucleation efficiency and reconstructed embryo development by means of blind enucleation and fluorescence microscopy.[Result] Treatment of IVM(in vitro maturation)19-21 h was significantly higher than IVM 16-18 h treatment in oocyte maturation rate(P<0.05)and was significantly higher than IVM 22-24 h treatment in enucleation rate(P<0.05).Three treatments had no significant difference in cleavage rate and blastocyst rate(P>0.05),but IVM 19-21 h treatment was significantly higher than the other 2 treatments in average cell number of blastocysts(P<0.05).[Conclusion] The appropriate in vitro maturation time of oocytes was 19-21 h for sheep nuclear transfer,which could significantly improve the quality of blastocysts according to the cell number per blastocyst(P<0.05).     

猪裸卵体外胞质成熟研究

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据。[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响。[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1 053.67)与COC组(1 426.00)和COC+GC组(1 541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26%)与COC组(92.75%)以及DO组(82.86%)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(94.98%)和囊胚率(43.67%)显著高于DO组卵裂率(52.54%)和囊胚率(8.97%),与COC组卵裂率(97.11%)和囊胚率(38.30%)差异不显著(P0.05);成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(72.65%)与DO组卵裂率(63.59%)无显著差异,但DO+MGC组囊胚率(17.79%)显著高于DO组(9.88%)(P0.05)。[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力。     

猪裸卵体外胞质成熟研究(英文)

[目的]改善猪裸卵的体外成熟质量,为建立稳定有效的裸卵培养体系提供科学依据。[方法]以第一极体排出比例、卵母细胞谷胱甘肽含量、亮甲酚蓝阳性率以及早期胚胎发育潜能等为主要衡量指标研究了卵泡壁颗粒细胞共培养对猪裸卵胞质成熟的影响。[结果]体外成熟结果表明,相对于DO组,DO+MGC组卵母细胞排除第一极体的比例无显著差异,但核成熟的进程得到了改善,更接近于COC组;成熟卵母细胞GSH含量检测结果表明,DO+MGC组平均每个卵母细胞谷胱甘肽含量(光密度1053.67)与COC组(1426.00)和COC+GC组(1541.00)差异不显著,但DO组(724.67)显著低于COC组和COC+GC组(P<0.05);G6PDH活性检测结果表明,DO+MGC组BCB阳性卵母细胞比例(88.26%)与COC组(92.75%)以及DO组(82.86%)差异均不显著,但DO组显著低于COC组(P<0.05);成熟卵母细胞孤雌激活后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(94.98%)和囊胚率(43.67%)显著高于DO组卵裂率(52.54%)和囊胚率(8.97%)(P<0.05),与COC组卵裂率(97.11%)和囊胚率(38.30%)差异不显著;成熟卵母细胞体外受精后的发育结果表明,DO+MGC组卵裂率(72.65%)与DO组卵裂率(63.59%)无显著差异,但DO+MGC组囊胚率(17.79%)显著高于DO组(9.88%)(P<0.05)。[结论]卵泡壁颗粒细胞共培养可以显著改善裸卵体外成熟的胞质成熟质量并进而提高后续发育潜力。     

“胰岛素-转铁蛋白-硒钠”对山羊卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响(英文)

[Objective] The research aimed to enhance culture efficiencies of oocyte and embryo of goat in vitro and to explore serum-free culture system in vitro.[Method] At present,the conventional solutions of oocyte maturation and embryo development in vitro were always added into 1% ITS(Insulin-transferrin-selenium) or using 1% ITS to replace FBS in 2 kinds culture solutions for conducting in vitro cultures of goat oocyte and parthenogenetic embryo.The influences of ITS on their developments were detected.[Result] ITS in maturation liquid of oocytes could not increase oocytes maturation rate but significantly increased blastocyst rate (58.06% vs. 48.19%)of parthenogenetic embryo.If FBS in maturation liquid of oocytes was replaced by ITS, the maturation rate, cleavage rate and blastocyst rate were basically unchanged.Adding ITS into embryo medium could increase blastocyst rate (68.30% vs. 56.82%)of parthenogenetic embryo of goat.If FBS in embryo medium was replaced by ITS,the cleavage rate didn’t change basically,while the blastocyst rate in ITS was obviously lower than that in FBS group(42.33% vs.56.82%).[Conclusion] ITS could promote maturation of oocyte in vitro and early embryonic development, in addition,ITS could replace serum in maturation medium of oocyte as serum-free culture system for conducting relevant researches.     

尿嘧啶和ATP对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响

[目的]探究尿嘧啶(Uracil)和三磷酸腺苷二钠盐(ATP)对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响。[方法]在体外成熟培养液中添加不同浓度的尿嘧啶和ATP,研究其对牛卵母细胞体外成熟及激活后孤雌胚胎发育能力的影响。[结果]在成熟培养液中添加50μg/ml尿嘧啶能够显著提高卵母细胞的成熟率、分裂率及孤雌胚胎囊胚率;在成熟培养液中分别添加0、250、500、750μg/mlATP,对卵母细胞成熟率影响不大,但添加500μg/ml ATP能显著提高激活后孤雌胚胎囊胚率。[结论]该研究为牛卵母细胞IVM研究提供了参考资料。