牛抵抗素对牛肺泡巨噬细胞TLR4/MyD88非依赖信号通路基因表达的影响

旨在探究牛抵抗素通过TLR4/MyD88非依赖信号通路诱发牛肺泡巨噬细胞的相关炎症反应机理。使用100 ng·mL^-1终浓度牛抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞,分别在0、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h时采用qRT-PCR检测TLR4/MyD88非依赖信号通路相关基因(TLR4、TRAM、NF-κB)mRNA水平表达量,通过ELISA法检测下游IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子表达水平。结果显示,100 ng·mL^-1牛抵抗素处理牛肺泡巨噬细胞后,TLR4、TRAM、NF-κB基因表达量于6.0 h时极显著上调(P<0.01),诱导12.0 h时,相关基因表达量达到最高;IL-6、1L-1β、TNF-α等促炎细胞因子于1.5 h表达量极显著上调(P<0.01),且均存在时间依赖效应。抵抗素诱导牛肺泡巨噬细胞后,可激活TLR4/MyD88非依赖信号通路,通过信号传递,释放大量促炎细胞因子,引起肺部炎症。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆和序列分析及其基因表达

采取三元杂交猪的外周血,提取单核细胞总RNA,采用RT-PCR克隆猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)cDNA(GenBank登录号为DQ108393)。以pcDNA3.1(-)为质粒载体,构建猪GM-CSF基因真核表达质粒pGM-CSF,对克隆片段进行测序,并进行不同物种间同源性的比较。将重组质粒转染COS-7细胞,Western blotting鉴定表达蛋白的特异性。序列分析表明,GM-CSF的cDNA开放阅读框为435 bp,编码144个氨基酸和大部分信号肽,与用作PCR引物设计的参考序列比较,其核苷酸的同源性为97.5%,氨基酸的同源性为95.1%,同绵羊、人、牛、小鼠和犬的GM-CSF序列比较,其核苷酸的同源性分别为86.2%、80.5%、81.7%、69.7%和81.8%,氨基酸的同源性分别为78.5%、71.3%、70.3%、55.9%和71.5%。Western blotting证实目的基因可以在真核细胞中特异性的表达GM-CSF蛋白。以上结果表明,猪的GM-CSF基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用GM-CSF增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。     

青蛤(Cyclina sinensis)ERK基因的克隆及其在Poly I:C刺激下的表达分析

[目的]研究青蛤(Cyclina sinensis) ERK基因的克隆及在Poly I:C刺激下的表达情况。[方法]在已建立的青蛤转录组文库中筛选得到青蛤细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases)基因类似序列。运用生物信息学软件在线对该基因进行结构分析。采用PCR技术克隆基因,并使用实时荧光定量PCR技术克隆得到Cs ERK基因在青蛤5个不同组织中的表达情况及在干扰素诱导剂PolyI:C的刺激下ERK基因在青蛤血淋巴中的时序性表达情况。[结果]ERK基因序列全长为2 407 bp,开放阅读框长1 338 bp,共编码445个氨基酸。ERK基因在青蛤的血淋巴、外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃5个组织中均表达,在血淋巴中表达量最高,闭壳肌中表达量最低。青蛤ERK基因在Poly I:C胁迫下表达量在6 h时达到最大值,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。[结论]ERK基因所指导合成的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。     

斜带石斑鱼热休克蛋白基因HSP70在LPS和Poly I∶C刺激下的表达分析及重组蛋白制备

为了解斜带石斑鱼Epinephelus coioides热休克蛋白(HSP70)基因(EcHSP70,GenBank登录号MW411059)在石斑鱼抗病原感染中的功能,采用荧光定量PCR检测了LPS与Poly I∶C刺激后48 h内,石斑鱼脾脏细胞(GS)中EcHSP70的表达变化;构建重组质粒EcHSP70-4T,转化到BL21(DE3)后进行诱导表达,利用SDS-PAGE电泳和Western blot检测EcHSP70重组蛋白的表达形式。结果表明:LPS与Poly I∶C刺激后,石斑鱼脾脏细胞中EcHSP70基因表达量上调;SDS-PAGE与Western blot检测表明,EcHSP70-4T重组蛋白相对分子质量约为96 000,主要以包涵体形式表达。研究表明,EcHSP70蛋白可能参与了石斑鱼的免疫反应,其在大肠杆菌中能以包涵体形式高效表达,并纯化获得了EcHSP70重组蛋白,本研究结果为鉴定EcHSP70的互作蛋白及进一步了解该蛋白在免疫反应中的作用机制提供了数据参考。     

猪H-FABP基因内含子3多态片段的序列分析(英文)

[Objective] The aim of this study was to provide a theoretical basis for exploring the major genes affecting intramuscular fat (IMF) deposition. [Method] Taking 383 pigs from five breeds including Mashen Pig, Large White Pig, Landrace, Duroc and Shanxi White Pig as the experimental animals, polymorphisms of partial fragments in the third intron of porcine H-FABP gene were detected by PCR-SSCP method, and then the polymorphic fragments were sequenced. [Result] Two alleles, designated as A and B, were found at the locus 346 in the third intron of porcine H-FABP gene, and the mutation was caused by a A→G substitution. [Conclusion] A polymorphic locus was discovered in the third intron of porcine H-FABP gene in this experiment, laying a foundation for the further study on the relationship between H-FABP gene and IMF content.     

中华鳖胚胎肝成纤维细胞的原代培养及其聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)刺激模型构建

为建立中华鳖胚胎肝成纤维细胞的体外分离培养体系,研究聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)刺激对细胞干扰素生成通路相关因子的影响,从而最终构建基于该成纤维细胞的干扰素生成通路激活模型,以发育至23期的中华鳖胚胎为实验材料,采用胰蛋白酶消化法得到肝成纤维细胞,结合细胞形态学、生长曲线和PCR法进行鉴定,并分析其生物学特性.之...