40 种中草药杀灭离体多子小瓜虫效果研究

研究了40种中草药不同浓度水提物对多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)的离体杀灭效果,结果表明:夏枯草、仙鹤草和三七等18种中草药在浓度为50g/L时才能在4h内杀灭多子小瓜虫滋养体;药物浓度为10g/L时,槐花、皂角刺和毛冬青等13种中草药可杀灭滋养体;药物浓度为1g/L时,紫荆和鹅不食草即可杀灭滋养体;药物浓度为0.1g/L时,只有生姜能杀灭多子小瓜虫滋养体。生姜水提物对滋养体和幼虫的最低致死浓度分别为100、50mg/L,半数有效浓度分别为30.3、15.7mg/L,100mg/L可完全抑制包囊孵化。由此可见生姜是一种可有效杀灭多子小瓜虫的中草药。     

花绒寄甲HSP7O基因的特征与表达

为阐明热休克蛋白70(HSP70)在花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)发育及雌雄成虫抵抗环境胁迫中的作用,利用实时荧光定量PCR技术分析了其在发育阶段和环境胁迫时的表达情况.从花绒寄甲转录组中获得3条HSP70基因,分别命名为D.hHSP69.09、D.hHSP70.11和D.hHSP7 1.88.发育阶段定量结果显示,3条HSP70在所有发育阶段均有表达,D.hHSP69.09在1龄幼虫期表达量最高;D.hHSP70.11和D.hHSP71.88在雄虫中表达量最高.在检测的成虫组织中,D.hHSP69.09和D.hHSP70.11在卵巢表达量最高;D.hHSP71.88在脂肪体中表达量最高.HSP70基因随温度升高(23℃升至44 ℃)、41℃下处理时间(0～ 270 min)延长、氧化剂浓度(0～ 70 mmol·L-1)的升高表达量先增加后减少,雌雄表达量差异较大.饥饿试验显示,雌雄虫表达模式不同;随饥饿时间延长,雄虫HSP70基因表达量有所降低,雌虫一定时间内有所上升.因此,花绒寄甲HSP70可能与不同发育期的转换、幼虫的蜕皮行为相关;HSP70对温度、氧化和饥饿胁迫的应激敏感程度和表达水平不同,能够有效应对高温、氧化、饥饿等环境胁迫.     

花绒寄甲HSP70基因的特征与表达

为阐明热休克蛋白70(HSP70)在花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)发育及雌雄成虫抵抗环境胁迫中的作用,利用实时荧光定量PCR技术分析了其在发育阶段和环境胁迫时的表达情况。从花绒寄甲转录组中获得3条HSP70基因,分别命名为D.h HSP69.09、D.h HSP70.11和D.h HSP71.88。发育阶段定量结果显示,3条HSP70在所有发育阶段均有表达,D.h HSP69.09在1龄幼虫期表达量最高;D.h HSP70.11和D.h HSP71.88在雄虫中表达量最高。在检测的成虫组织中,D.h HSP69.09和D.h HSP70.11在卵巢表达量最高;D.h HSP71.88在脂肪体中表达量最高。HSP70基因随温度升高(23℃升至44℃)、41℃下处理时间(0~270 min)延长、氧化剂浓度(0~70 mmol·L-1)的升高表达量先增加后减少,雌雄表达量差异较大。饥饿试验显示,雌雄虫表达模式不同;随饥饿时间延长,雄虫HSP70基因表达量有所降低,雌虫一定时间内有所上升。因此,花绒寄甲HSP70可能与不同发育期的转换、幼虫的蜕皮行为相关;HSP70对温度、氧化和饥饿胁迫的应激敏感程度和表达水平不同,能够有效应对高温、氧化、饥饿等环境胁迫。     

海带热休克蛋白70基因体外原核表达研究

在前期研究克隆得到全长海带HSP70基因的基础上,为进一步研究藻类HSP70的生物学功能,将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导,其表达量达到平台期,继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。     

复方中草药对凡纳滨对虾热应激蛋白7O基因表达的影响

采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）,分别对在基础饲料中添加了1％复方中草药的试验组和只喂食基础饲料的对照组凡纳滨对虾的肝组织进行HSP70基因的mRNA表达检测,并以18S rRNA为内参照进行基因表达水平的半定量分析。结果显示,试验组凡纳滨对虾的肝组织HSP70基因的mRNA表达显著高于对照组（p〈0．05）,说明复方中草药可提高凡纳滨对虾HSP70基因mRNA的表达量,表明在饲料中添加复方中草药有利于凡纳滨对虾的生长和抗病、抗逆功能的增强。     

水牛热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

【目的】克隆水牛热休克蛋白70基因（HSP70）并进行生物信息学分析,同时明确HSP70基因在水牛成熟卵母细胞（MII期）和2-细胞期胚胎中的表达情况,为研究HSP70在水牛卵母细胞成熟及着床前早期胚胎发育中的作用机理提供理论依据。【方法】根据NCBI已公布的水牛HSP70基因mRNA预测序列（MH814759.1）设计引物,通过RTPCR克隆水牛HSP70基因,运用DNAStar、MEGA 7.0、TMHMM 2.0及SignalP 4.1 Server等在线软件进行生物信息学分析;同时采用细胞免疫荧光分析HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中的表达情况。【结果】水牛HSP70基因编码区（CDS）长度为1926 bp,共编码641个氨基酸残基。克隆获得的水牛HSP70基因序列与NCBI已公布水牛HSP70基因mRNA预测序列（MH814759.1）的相似性高达97.7%;与牛、家犬、山羊、小鼠、绵羊和大鼠的HSP70基因序列具有较高的相似性,其中与牛的相似性高达99.1%。基于HSP70基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,水牛与牛的亲缘关系最近。水牛HSP70分子量为70.27 kD,分子式为C₃₀₈₈H₄₉₆₇N_8670972S₁₅,理论等电点（pI）为5.67,不稳定系数为32.84,属于稳定蛋白;不存在跨膜结构及信号肽,主要定位于细胞质（60.9%）、细胞核（30.4%）及线粒体（8.7%）,其亲水性较强;水牛HSP70蛋白结构以α-螺旋和β-折叠为主。HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质。【结论】水牛HSP70基因在进化过程中具有高度的保守性,在水牛成熟卵母细胞和着床前早期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质,属于结构型HSP70。     

西伯利亚鲟热休克蛋白HSP70cDNA的克隆、序列分析和组织分布

采用普通PCR和RACE技术克隆了西伯利亚鲟Acipenser baerii热休克蛋白HSP70 cDNA的全序列,该序列全长为2 343 bp,其中5＇非编码区为140 bp,3＇非编码区为256 bp,可读编码框（ORF）为1 947bp,编码为648个氨基酸。该氨基酸序列中含有HSP70家族的3个特征序列——IDLGTTYS、IFDLGGGTFD-VSIL和IVLVGGSTRIPKIQK,细胞质特征性保守序列为EEVD,C端重复序列为GGMP。该cDNA序列与其它生物的HSP70 cDNA序列一样具有很高的相似性。系统发育树显示,西伯利亚鲟与非洲爪蛙蟾Xenopus laevis、密西西比短吻鳄Alligator mississippiensis、美西螈Ambystoma mexicanum的亲缘关系较近。实时定量分析结果表明,水温为17.5℃时,西伯利亚鲟肝脏、鳃、脾脏、心脏、肌肉、中肠、性腺、脑8种组织中均有HSP70表达,其中HSP70在脾脏中的表达量最高,鳃中的次之,肝脏中最低（P〈0.05）。     

链霉菌-XY52代谢产物对小瓜虫的体外杀灭活性研究

[目的]研究链霉菌发酵代谢产物对小瓜虫幼虫和包囊的杀灭活性.[方法]通过不同极性溶剂回流提取链霉菌发酵液,制备粗提物,进行杀灭小瓜虫幼虫和包囊的药效活性试验,并对活性部位进行安全性评价.[结果]链霉菌发酵液的乙酸乙酯和正丁醇提取物体外杀幼虫效果明显高于其他组别,其对小瓜虫幼虫的半数致死浓度分别为48.2和15.5 mg/L,正丁醇提取物浓度为30.0 mg/L时对小瓜虫包囊杀灭率为100％.急性毒性试验结果表明,正丁醇提取物对草鱼的48h半致死浓度为(LC50)为195.0 mg/L,其安全浓度为48.7 mg/L.[结论]链霉菌-XY52代谢产物有望开发为一种比较安全的杀虫候选药物.     

36种天然植物提取物抗多子小瓜虫活性研究

研究36种天然提取物对多子小瓜虫的体外和体内杀虫活性。利用水提法和醇提法制备36种天然植物的提取物，构建体外和体内杀小瓜虫药效模型，研究36种天然植物提取物抗小瓜虫的活性。实验结果表明，牛蒡子、小果博落回、丁香、博落回、大黄等7种天然植物提取物可100%杀灭小瓜虫的掠食体和包囊。其中，大黄乙醇提取物杀虫效果最佳，其浓度达到10.0 mg·L^-1时，可100%抑制小瓜虫包囊的分裂孵化；其浓度为5.0 mg·L^-1时，可100%杀灭小瓜虫掠食体。浸泡使用30.0 mg·L^-1大黄乙醇提取物后，草鱼鱼体感染小瓜虫的数量显著减少，存活率可达65.8%,而对照组存活率仅为30.0%。大黄乙醇提取物对多子小瓜虫具有较好的杀灭作用。     

过氧乙酸对小瓜虫幼虫和包囊的杀灭效果

采用过氧乙酸对4种主要养殖鱼类进行急性毒性试验,测试了过氧乙酸对小瓜虫幼虫和不同发育阶段包囊的杀灭效果。结果显示:过氧乙酸对斑点叉尾鲴、草鱼、奥尼罗非鱼,鲫鱼的安全浓度依次为1.73、3.00、3.57、5.20 mg/L。过氧乙酸在浓度为6.250 mg/L时,0.5 h即能杀死全部小瓜虫幼虫;在1.562 mg/L时,1 h即能杀死全部幼虫。过氧乙酸对不同发育阶段的包囊都具有一定的杀灭效果,当过氧乙酸的浓度为6.250、3.125、1.562 mg/L时,刚脱落的包囊的死亡率依次为75.63%、45.60%、25.60%,脱落2h的包囊的死亡率分别为64.23%、46.32%、20.20%,脱落10 h的包囊的死亡率分别为65.86%、35.07%、10.20%。因此,过氧乙酸在较低的浓度范围内对小瓜虫的幼虫和包囊具有一定的杀灭效果。     

热应激条件下小鼠睾丸组织HSP70基因表达谱的研究

本试验建立了不同温度、不同时间热应激实验小鼠动物模型,采用Real-time PCR和Western-blot方法检测了小鼠睾丸组织热应激蛋白70(HSP70)在mRNA和蛋白质水平的表达规律。结果表明:25℃时,HSP70在mR-NA和蛋白质表达水平没有变化;在31℃、34℃和37℃时,随应激时间的延长,HSP70mRNA和蛋白质的表达均呈现先升高后下降的趋势;40℃时,HSP70mRNA和蛋白质始终持续高表达。结论:小鼠受热应激后,睾丸组织HSP70mRNA和蛋白质均随着温度和时间的增加呈规律性变化,本研究为探索HSP70对精液品质的影响奠定了基础。     

花楸树热激蛋白SpHSP70-2基因的克隆及表达分析

探究花楸树响应高温胁迫的分子机制,为遗传改良和耐热品种的选育提供基础,依托花楸树叶片转录组测序数据,采用反转录PCR（RT-PCR）方法克隆得到HSP70家族中的1个基因,命名为SpHSP70-2,同时对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对其组织特异性和应答高温胁迫的表达模式进行了分析。结果表明,经克隆得到的SpHSP70-2基因与花楸树叶片转录组测序数据的基因序列一致,SpHSP70-2开放阅读框（ORF）长度为1 704 bp,编码567个氨基酸。SpHSP70-2蛋白具有HSP70特征结构域:核苷酸结合结构域（NBD）和底物结合结构域（SBD）;SpHSP70-2基因无内含子;SpHSP70-2二级结构中具有ɑ螺旋（32.63%）、延伸链（23.28%）、β转角（7.23%）和随机卷曲链（36.86%）;SpHSP70-2蛋白为疏水性蛋白,有11个跨膜螺旋,无信号肽;SpHSP70-2与同科的苹果、白梨的HSP70同源性最高,为90%以上;SpHSP70-2在花楸树的果实中表达量最大,在茎、根中表达量次之,在花中的表达量最小;在42℃高温胁迫处理下,SpHSP70-2表达量呈现先升高后下降趋势,在2 h时达到极值,随后表达量略缓慢下降,说明SpHSP70-2基因参与调控花楸树对高温胁迫的响应。研究结果为今后花楸树响应热胁迫的分子机制研究和引种驯化方面提供基础。     

丽江双团棘胸蛙热驯化中HSP70表达量的变化

用Western Blotting方法检测在不同温度梯度及不同时间热驯化下,丽江双团棘胸蛙肝脏、心脏、脑及皮肤等器官组织HSP70的表达情况。结果表明：丽江双团棘胸蛙各器官HSP70表达量与热驯化温度和时间长短有关,在15,20,30,35％热驯化过程中,各温度条件下各器官的HSP70表达水平有差异,表明热效应会影响活体中HSP70蛋白的表达水平。     

温度对黑腹果蝇生长发育、繁殖和种群增长的影响

黑腹果蝇Drosophila melanogaster Meigen是杨梅、樱桃等浆果果实最主要害虫。为明确温度对黑腹果蝇种群增长的影响,掌握黑腹果蝇饲养合适温度,在室内观察了黑腹果蝇在15,20,25,30和35℃条件下的生长发育、存活与繁殖能力,并计算各温度条件下的种群增长参数。结果表明：在35℃条件下,黑腹果蝇不能完成发育,其他温度条件下黑腹果蝇从卵孵化至蛹羽化成成虫,发育速率随温度升高明显加快,在15℃下,完成发育需要长达41 d,而在30℃下,黑腹果蝇完成发育仅需7 d;黑腹果蝇成虫寿命随温度的升高而明显缩短,在15℃下,雌、雄平均寿命分别高达70,80 d,在30℃下,平均寿命都仅为30 d;黑腹果蝇在20和30℃的平均繁殖力没有显著差异,分别为138.85和137.97粒卵·雌-1,但在以上条件下的平均繁殖能力显著低于25℃条件下的平均繁殖力,25℃条件下黑腹果蝇平均产卵量高达375.4粒（P<0.01）;黑腹果蝇的种群增长参数净生殖率（R0）、内禀增长率（rm）,在25℃时达最高值分别为55.10和1.021 d-1,而在15℃条件下值最小,分别为36.67和0.189 d-1。据此得出,25℃是最适宜黑腹果蝇生长发育和繁殖的温度,温度过高或过低都不利于黑腹果蝇种群增长。黑腹果蝇的发育起点温度为12.8℃,充分完成发育所需的有效积温为123.3日·度。     

冷刺激不同时间仔猪3种组织HSP70表达的Western blot检测分析

采用50日龄的雄性"军牧一号"仔猪进行冷刺激试验,分别在冷刺激0、0.5、3、6、12、24h与应激恢复0.5、3、6、12、24、48h共12个时间点采取仔猪肝脏、脾脏和股二头肌样品。利用Western blot检测冷刺激(-7±2℃)不同时间仔猪肝脏、脾脏与股二头肌HSP70的表达量,探讨冷刺激对机体3种主要器官内HSP70表达量的影响。结果显示仔猪肝脏、脾脏和股二头肌中HSP70的表达量都以不同程度的升高,而后呈现先下降再升高的变化趋势。结果提示肝脏、脾脏和股二头肌3种组织尤以肝脏HSP70表达量变化明显,提示冷应激反应中代谢最旺盛的器官肝脏中物质代谢可能与HSP70的表达量有关。     

不同温度、湿度水平下沼泽小叶桦光合日动态初步研究

利用Li-6400光合测定系统,对不同温度、湿度水平下沼泽小叶桦叶片光合速率的日变化规律进行了研究。结果表明：对照（20～30℃,RH 50%）和处理1（25～35℃,RH60%）条件下,沼泽小叶桦的光合速率均呈＂单峰＂型,适当的温度湿度提高可以促进沼泽小叶桦叶片的光合能力。高温高湿条件（30～40℃,RH70%）对沼泽小叶桦叶片光合速率有明显抑制作用,抑制作用是＂气孔因素＂与＂非气孔因素＂共同作用的结果。     

急性高温胁迫对翘嘴鳜幼鱼抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达的影响

【目的】从抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达层面明确高温胁迫对翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）幼鱼生长及应激生理响应的影响,为实际生产中翘嘴鳜幼鱼培育提供可靠的参考依据。【方法】对2月龄翘嘴鳜幼鱼进行96 h的急性高温胁迫,通过预试验测试高起始致死温度（96 h-UILT₅₀）,采用突变升温方法设常温对照组（26.0℃）和急性高温胁迫组（36.0℃）,分别于胁迫0、6、12、24、48和96 h后取样,使用生化试剂盒测定抗氧化酶和消化酶活性,并以实时荧光定量PCR检测热休克蛋白基因（HSP70α和HSP90α）的表达情况。【结果】翘嘴鳜幼鱼死亡率随水温的升高不断上升,其96 h-UILT₅₀为36.22℃。在96 h的急性高温胁迫过程中,翘嘴鳜幼鱼肝脏超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性呈降低-升高-降低的变化趋势,谷丙转氨酶（GPT）活性及丙二醛（MDA）含量则表现出升高-降低-升高的变化趋势;在消化酶方面,翘嘴鳜幼鱼胃蛋白酶和肠道淀粉酶（AMS）活性呈降低-升高-降低的变化趋势,而肠道脂肪酶（LPS）活性呈升高-降低-升高的变化趋势。在急性高温胁迫过程中,翘嘴鳜幼鱼HSP70α基因相对表达量呈升高-下降的波动式变化趋势,于胁迫12 h时达最高值,在胁迫48 h时出现第2个峰值;HSP90α基因表达呈先升高后降低的变化趋势,于胁迫24 h时上调至最高值;但至胁迫96 h时HSP70α和HSP90α基因的相对表达量仍显著高于对照组翘嘴鳜幼鱼（P<0.05）。【结论】急性高温胁迫对翘嘴鳜幼鱼抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达产生显著影响。其中,热休克蛋白基因HSP70α和HSP90α参与高温胁迫应答过程的生理调节,以应对高温胁迫对肝脏细胞的损伤,故可作为高温胁迫应答的标志物。     

肉鸡HSP70的基因克隆、原核表达及单克隆抗体制备

 【目的】制备高特异性的肉鸡热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）单克隆抗体,研究肉鸡HSP70与热应激损伤的关系。 【方法】 利用RT-PCR方法扩增肉鸡HSP70 mRNA,将其扩增产物克隆到PGEM-T Easy 载体和原核表达载体pET-28a(+)上,进一步转化至大肠杆菌BL-21中,用IPTG诱导表达重组肉鸡HSP70。以纯化的重组肉鸡HSP70制备多克隆抗体,免疫印迹分析说明重组肉鸡HSP70具有很好的免疫原性。以纯化的重组肉鸡HSP70免疫Balb/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。【结果】获得2株分泌肉鸡HSP70单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步通过免疫印迹分析筛选出1株高特异性的肉鸡HSP70单克隆抗体,命名为BH70-1。 【结论】免疫组织化学结果显示,单克隆抗体BH70-1是一种理想的抗体。     

不同培养液和温度诱导球孢白僵菌BF菌株产酶特性的研究

分别采用Folin-酚法和DNS法对球孢白僵菌BF菌株在不同培养液、不同温度下产蛋白酶和几丁质酶的活性进行了研究。结果表明,白僵菌在3种不同的培养液中均能产生蛋白酶和几丁质酶。30℃以下时,以明胶培养液中产蛋白酶的活性最高（28℃时为127.09 U）;30℃以上时,以虫尸粉培养液产酶活性最高（35℃时为133.51 U）;球孢白僵菌在胶体几丁质中诱导几丁质酶的效果最好,其中30℃时酶活性最高（2.91 U）;其次为虫尸粉培养液,在28℃时酶活性最高（1.44 U）;细粉几丁质培养液的诱导效果在5个温度下都是最差;温度高于30℃时,这3种培养液诱导的几丁质酶活性都非常低。     

薄壳山核桃‘马汉’雄蕊发育特性及花粉储藏活力

为解决薄壳山核桃Carya illinoensis花期花粉的采集和有效保存等问题,系统观测雄蕊开花习性,采用荧光染色反应(FCR)法研究了不同散粉期花粉生活力差异,以及不同储藏条件(室温密封、室温密封干燥;4℃密封、4℃密封干燥;-70℃密封、-70℃密封干燥)和储藏时间对花粉活力的影响。结果表明:①4月26日薄壳山核桃雄蕊花萼开裂,5月6日花药由绿变黄,5月7-9日雄蕊进入散粉期,5月8日散粉量最大,占花粉总量的75%,至5月10日花粉基本散尽,花药变黑、小花开始脱落;②散粉期花粉生活力大小依次为即将散粉期(花药由绿变黄)>散粉初期>散粉盛期>散粉末期,花粉耐储藏性亦是即将散粉期最优,即将散粉期>散粉初期>散粉盛期>散粉末期。③储藏条件对花粉活力的保持有显著影响,利于花粉生活力保持的储藏条件依次为-70℃密封干燥>-70℃密封>4℃密封干燥>4℃密封>室温密封干燥>室温密封;在任一储藏条件下,花粉活力均随储藏时间而下降,干燥与不干燥差异不显著。室温下花粉活力下降最快,50 d后花粉已经完全丧失活力;4℃下花粉活力次之,120d后花粉已经完全丧失活力;-70℃超低温条件下保存效果最好,与常温、低温储藏差异极显著,储藏360 d花粉还保持43.55%的活力。