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相似文献
 共查询到16条相似文献,搜索用时 187 毫秒
1.
【目的】构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础。【方法】以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒 p8K-HA/M/NA。表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。【结果】PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M1和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80~120 nm 的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。【结论】重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒。  相似文献   

2.
【目的】构建甲型流感病毒H1N1血凝素基因HA/HA1的真核表达载体,并检测其在BHK-21细胞中的表达。【方法】按照人的偏爱密码子,对H1N1流感病毒的HA/HA1基因进行优化改造,以提高其表达量,经全基因合成后插入到真核表达载体pSNAV中,构建了真核表达质粒pSNAV-Mod. HA与pSNAV-Mod. HA1;质粒转染BHK-21细胞,G418筛选后,用免疫荧光及Western blot技术检测其表达情况。【结果】成功构建了血凝素基因HA/HA1的真核表达载体。经G418筛选得到单克隆,免疫荧光技术和Western blot检测10代,显示Mod. HA和Mod. HA1皆可在BHK-21细胞中稳定表达。【结论】成功构建的流感病毒HA和HA1真核表达载体,可为今后开展多基因表达的基因工程疫苗及H1N1检测试剂奠定基础。  相似文献   

3.
【目的】本试验旨在构建A型H7N9流感病毒RNA聚合酶类蛋白PB1和PB2真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。【方法】首先提取苏州分离株A型H7N9流感病毒的总RNA,通过RT-PCR技术获得了A型H7N9流感病毒PB1和PB2的全长基因,然后将其克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-Flag-PB1/PB2真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定PB1/PB2蛋白的表达。【结果】成功克隆了PB1和PB2全长基因,构建了A型H7N9流感病毒PB1和PB2蛋白真核表达载体pRK-Flag-PB1/PB2,并在293T细胞中转染表达,Western blot确定了PB1/PB2蛋白的成功表达。【结论】该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达PB1和PB2蛋白,为后期开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用的研究奠定了基础。  相似文献   

4.
【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。  相似文献   

5.
【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示:miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。  相似文献   

6.
M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA(shRNA)的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50%,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%~64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48 h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10~1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。  相似文献   

7.
【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。  相似文献   

8.
【目的】为了探明猪圆环病毒3型的致病机制。【方法】用PCR技术扩增PCV3的ORF1-ORF7基因片段并克隆到pEGFP-C1载体,构建7个真核表达质粒后分别转染PK-15细胞,在转染后不同时间观察细胞中荧光表达情况,并检测Caspase-3活性变化。【结果】7个真核表达质粒转染PK-15细胞后均可观察到荧光,表明PCV3的ORF1-ORF7基因均可在PK-15细胞中获得表达,但在表达丰度方面存在差异。与单独的PK-15细胞和pEGFP-C1载体转染的PK-15细胞相比,7个真核表达质粒转染PK-15细胞后都未出现Caspase-3活性的显著(P0.05)变化,表明均未引起PK-15细胞发生凋亡。【结论】PCV3的ORF1-ORF7基因均无诱导PK-15细胞发生凋亡的作用。  相似文献   

9.
H5N1型禽流感模型侵染病毒的构建与鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1       下载免费PDF全文
【目的】构建含有H5N1型禽流感病毒HA、NA的侵染模型病毒,并对构建的模型病毒进行侵染活性及特异性检测。【方法】采用PCR方法扩增出H5N1型AIVHA和NA基因,经纯化回收后将其分别克隆至真核表达载体pcDNA4.0中,构建pcDNA-HA、pcDNA-NA。然后采用磷酸钙共转染方法,将pcDNA-HA、pcDNA-NA和含有LUC报告系统的HIV骨架表达载体pNL4-3.Luc.R-E-,共同转染293T细胞,构建HIV/HA-NA模型病毒,对HIV/HA-NA模型病毒进行细胞侵染活性及特异性检测。【结果】HA、NA基因片段真核表达载体pcDNA-HA、pcDNA-NA与HIV骨架载体在293T细胞中成功表达组装,获得了HIV/HA-NA侵染模型病毒;敏感细胞特异性检测及侵染活性分析表明,HIV/HA-NA模型病毒与其野毒具有共同的敏感细胞。报告系统数据显示,模型病毒可以定量检测其对细胞的侵染程度。【结论】成功构建HIV/HA-NA模型侵染病毒,可以模拟H5N1病毒的侵染过程,定量报告病毒的侵染程度,并且该模型病毒不具有增殖能力,安全可靠,可以方便地用于普通实验室AIV抗体检测和特定药物的筛选。  相似文献   

10.
【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。  相似文献   

11.
【目的】探讨H9N2亚型流感病毒在野鸟中的存在与传播,为广西流感疫情动态监测和防控及人流感预防监测提供重要依据。【方法】采集广西野鸟肺脏组织,将病料接种于9~11日龄SPF鸡胚尿囊腔进行分离培养,血清学试验鉴定HA和NA亚型,并克隆扩增其HA和NA基因。【结果】该分离株能被H9亚型阳性血清抑制,神经氨酸酶抑制(NI)试验结果将其鉴定为N2亚型,判断该病毒属于H9N2亚型流感病毒,命名为A/wild bird/Guangxi/H2/07,对HA和NA基因进行序列分析,发现与流感病毒H9亚型和N2亚型同源性最高,分别达到82.4%~99.0%和83.1%~99.9%。【结论】H9N2亚型流感病毒已在广西野鸟中存在,该结论为广西流感疫情动态监测和防控提供了重要依据。  相似文献   

12.
《中国农业科学》2009,42(5):1797-1804
 【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1﹕64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1﹕1 024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1﹕32以上,三免后2周HI抗体平均效价达到1﹕512,说明其有良好的免疫原性。【结论】H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。  相似文献   

13.
表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果   总被引:12,自引:0,他引:12  
【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS,构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白,随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白,载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI;免疫SPF鸡后,100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护,100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护,10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护,而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护,pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,增强免疫保护效果。  相似文献   

14.
【目的】明确犬源H9N2亚型流感病毒的分子变异特征及致病性,为今后探究流感病毒的禽—犬跨种传播机制提供科学依据。【方法】从流浪犬中分离H9N2亚型流感病毒,利用RT-PCR扩增其8个基因节段进行BLAST同源比对,然后基于国内外的22株参考毒株进行遗传进化分析,并通过小鼠滴鼻感染试验评估分离毒株的致病性。【结果】从采集的393份犬鼻拭子样品中分离获得1株H9N2亚型流感病毒,命名为A/canine/Guangxi/LZ11/2018(简写为LZ11)。分离毒株LZ11为三重组毒株,其中,HA、NA和NS基因属于BJ/94类谱系,PB2和M基因属于G1类谱系,PB1、PA和NP基因属于F/98类谱系;病毒基因组成属于近年我国广泛流行的S基因型。分离毒株LZ11的HA蛋白在第324~331位存在1个裂解位点(PSRSSR↓GL),符合低致病性流感病毒的特征;HA蛋白还出现226Q→L突变,具有优先结合人类α-2,6唾液酸受体的能力;NA蛋白在119E、151D、276E、292R和294N未发生突变,但M2蛋白出现31S→N突变,说明分离毒株LZ11仍对神经氨酸酶抑制剂敏感,但已对金刚烷胺类药物产生耐药性;聚合酶蛋白出现多个哺乳动物适应性相关的氨基酸位点突变,包括PB2蛋白的292I→V、PB1蛋白的368I→V及PA蛋白的409S→N和356K→R。分离毒株LZ11虽然未引起小鼠出现典型的临床症状,但可在肺脏和上鼻窦有效复制,病毒滴度分别为3.82和5.98 lg PFU/mL。【结论】分离获得的犬源H9N2亚型流感病毒属于近年流行的S基因型,其8个基因节段分属于3种谱系(BJ/94类谱系、G1类谱系和F/98类谱系),且存在多个哺乳动物适应性相关氨基酸位点突变,具备感染哺乳动物的分子特征,可在小鼠脏器内有效复制。鉴于人类与宠物犬的密切关系,今后应加强对犬源H9N2亚型流感病毒的监测与防控。  相似文献   

15.
【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV9病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,  相似文献   

16.
【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。  相似文献   

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