小麦抗旱相关基因TaCRT-D单核苷酸多态性分析

 【目的】钙网蛋白（CRT）是细胞内质网膜上的钙结合蛋白，参与多种细胞功能的调节。研究小麦钙网蛋白基因TaCRT-D单核苷酸多态性，并分析其与抗旱性的关系。【方法】以苗期抗旱性不同的37份六倍体普通小麦和3份普通小麦D基因组供体种粗山羊草为材料，通过直接测序分析TaCRT-D基因的单核苷酸多态性（SNP）及其与抗旱性的关系。【结果】TaCRT-D基因DNA长度为4 001 bp，在长达160 040 bp的核苷酸序列中共检测到105个单核苷酸变异位点，包括84个SNP和21个InDel，二者出现的频率分别为1/1 905和1/7 621，编码区的核苷酸多样性值（π）小于非编码区，说明编码区所承受的选择压力较大，遗传变异小于非编码区。单倍型分析表明，40份供试材料分为8种单倍型，其中单倍型H1中11份材料包括4份中等抗旱材料和7份干旱敏感材料;单倍型H3、H4和H7既有抗旱性强的材料也有干旱敏感材料;单倍型H5只包括3份小麦D基因组供体种材料。【结论】普通小麦TaCRT-D基因中SNP频率较低，TaCRT-D基因单核苷酸多态性与小麦苗期抗旱性之间没有明显的对应关系。     

小麦TaDREB1基因的单核苷酸多态性分析

 TaDREB1是一种转录因子，调控抗旱等抗逆相关基因的表达。以抗旱性不同的20份六倍体小麦和3份小麦的二倍体近缘种为材料，用直接测序法筛查TaDREB1基因DNA序列的单核苷酸多态性，在23份材料的38 038bp序列中发现了271个SNP和14个InDel，平均140 bp中有1个SNP，2 717 bp中有1个InDel。核苷酸多样性（Л）分析表明，小麦二倍体近缘种的Л值（0.02188）明显大于六倍体小麦的Л值（0.01029），说明该基因在二倍体种中的变异程度大于六倍体小麦，可能原因是六倍体小麦长期承受强大的人工选择压力。单倍型分析揭示了TaDREB1基因单核苷酸多态性与抗旱性表型的相关性，但同时也发现在个别单倍型里既有抗旱型材料又有对水分比较敏感的材料，揭示了抗旱性的复杂性，说明仅用TaDREB1基因的单核苷酸多态性还不能完全解释抗旱性复杂的表现型。     

小麦抗旱相关基因TaGSTF6的多态性

【目的】研究TaGSTF6基因多态性与抗旱性的关系。植物谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）是一类重要的受逆境胁迫诱导表达的酶类，能减少干旱等逆境胁迫导致的体内活性的氧积累，在植物的抗旱反应中发挥重要作用。【方法】以86份抗旱性不同的普通小麦品种和7份粗山羊草为材料，检测TaGSTF6基因的核苷酸序列长度及碱基组成多态性，并预测氨基酸序列多态性。【结果】Northern分析结果表明，小麦幼苗中TaGSTF6基因受水分胁迫诱导表达。序列多态性分析发现在长达113.6 kb的核苷酸序列中有47个单核苷酸变异位点，其中23个SNP，24个InDel，二者的频率分别为1SNP/4 940bp和1InDel/4 734bp，粗山羊草中SNP和InDel出现的频率明显高于普通小麦；仅在11份材料中预测到氨基酸序列多态性。根据核苷酸序列变异可能导致的氨基酸变异把基因编码区的变异分为两类：核苷酸转换或颠换导致的单个氨基酸变异；碱基缺失导致的移码突变或翻译提前终止，其中大多数变异属于移码突变。【结论】尽管小麦基因组庞大，重复序列多，但在功能基因TaGSTF6中SNP的分布频率非常低；虽然TaGSTF6受水分胁迫诱导表达，但其结构多态性分析未能揭示其多态性与小麦抗旱性之间的直接关系。     

小麦TaSnRK2.10的多态性及与农艺性状的关联

【目的】蔗糖非发酵蛋白激酶（SnRK）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物信号传递途径中发挥着重要作用。研究小麦TaSnRK2.10的多态性,开发其功能标记,并进行标记-表型性状关联分析,为利用分子标记进行遗传改良和种质创新提供依据。【方法】以30份多态性较高的六倍体普通小麦及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料,通过测序分析TaSnRK2.10-A的序列多态性;利用中国春缺-四体材料对该基因进行染色体定位;利用RIL群体（偃展1号×内乡188）对基因进行遗传定位;根据TaSnRK2.10-A序列多态性,开发分子标记,以262份普通小麦构成的自然群体为材料分析基因单倍型与表型性状的关联特性。【结果】克隆了小麦TaSnRK2.10的A、D基因组序列,在由30份多态性较高的小麦材料组成的自然群体中,没有检测到来自D基因组的TaSnRK2.10-D序列多态性;TaSnRK2.10-A全长4 688 bp,包括启动子1 934 bp、5′-UTR 343 bp、编码区2 319 bp及3′-UTR 92 bp。在基因全长序列中共检测到15个SNP、2个InDel。其中,启动子区有8个SNP,5′-UTR有2个,编码区有5个。位于编码区的5个SNP中,2个存在于外显子,其中一个是非同义突变。2个InDel均位于编码区。根据序列多态性分别设计了启动子区的分子标记PM1和PM2,以及基因编码区的分子标记GM1和GM2。利用中国春缺-四体材料将TaSnRK2.10-A定位于小麦染色体4A,利用RIL群体将TaSnRK2.10-A定位在染色体4A的标记Xwpt7001和WMC48之间,与2个侧翼标记的遗传距离分别为5.1 cM和25.7 cM。利用开发的4个分子标记,将自然群体的262份材料分为4种单倍型,分别与千粒重、单株穗数和每穗小穗数显著相关或极显著相关,HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型。4 184 bp位点为C时,为高千粒重的优异等位变异。【结论】小麦TaSnRK2.10-A位于染色体4A。HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型,HapⅣ是提高单株穗数的优异单倍型,4 184 bp位点的胞嘧啶（C）是优异等位变异。     

基于全基因组SNP标记的抗旱冬小麦品种的遗传多样性分析

【目的】研究分析124份优异抗旱冬小麦的亲缘关系和遗传多样性,为小麦抗旱亲本选择提供理论依据.【方法】利用35K基因芯片对小麦全基因组进行扫描,并在PowermarkerV3.2.5中计算等位变异频率、遗传多样性指数和多态性信息量;采用非加权平均法(UPGMA)对124份小麦材料进行分类.【结果】通过全基因组扫描,共筛选出15 947个多态性SNP标记,每个多态性SNP位点平均等位变异频率为0.75,遗传多样性指数为0.35,多态性信息量为0.31,根据遗传相似系数,采用UPGMA在遗传相似系数0.38处将124份冬小麦材料分为7个亚群.【结论】在长期的育种过程中促进了不同区域的小麦种质材料之间的基因交流,但是在部份相同地理来源的材料之间的遗传多样性仍较差,因此在育种过程中应该引进新的品种,丰富小麦的遗传背景.     

大麦糯性相关基因Wx单核苷酸多态性分析

【目的】大麦Wx是控制直连淀粉合成相关的糯性基因,研究大麦糯性相关基因Wx单核苷酸多态性,并分析其与籽粒直链淀粉含量的关系。【方法】以2个国外糯大麦品种为对照,对30份高、中、低直链淀粉含量的中国大麦进行Wx的克隆和测序,分析Wx的单核苷酸多态性(SNP)及其与籽粒直链淀粉含量之间的关系。【结果】在对32个大麦品种的核苷酸序列多态性鉴定中,共检测到了169个多态性位点,平均每26bp检测到一个多态性位点。在所有检测到的多态性位点中,包括143个SNP和26个InDel,二者的频率分别为1/310和1/169。Wx的内含子1、3、5、8区,外显子2、5和5′-UTR及3′-UTR区域为变异富集区,其它区域变异较小。外显子2和内含子1区域所承受的选择压力较小。单倍型分析表明,第1种单倍型中包括所有低直链淀粉含量的材料。【结论】大麦Wx的多态性与直链淀粉含量之间存在明显的对应关系。     

小麦转录因子基因W16的功能标记作图和关联分析

【目的】开发小麦DREB转录因子基因W16的功能标记,进行遗传作图,并结合表型性状关联分析,为利用分子标记进行小麦遗传改良提供依据。【方法】以六倍体普通小麦及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料,克隆W16的DNA序列;根据序列多态性设计分子标记;利用中国春缺四体材料对基因进行染色体定位,用DH群体(旱选10号×鲁麦14)进行精细定位并作图;以154份六倍体普通小麦材料构成的自然群体分析表型性状与基因单倍型的关联特性。【结果】利用中国春缺四体材料先将W16定位在1A染色体上。后利用DH群体将W16定位于染色体1A的CWM517和WMC20标记之间,距左、右标记的遗传距离分别为7.8 cM和19.4 cM。在小麦自然群体中共检测到W16的3种单倍型,分别与单株穗数、穗粒数、每穗小穗数和籽粒饱满度关联。【结论】确定了W16所在的染色体位置,鉴定出HapⅡ为增加单株穗数和籽粒饱满度的优良单倍型,HapⅢ为提高穗粒数的优良单倍型,该基因的功能标记和关联分析结果为小麦分子育种提供了重要信息。     

用等位基因特异PCR检测普通小麦（Triticum aestivum L.）的单核苷酸多态性

 【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系（RIL）的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料，研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列，在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3?端，设计等位基因特异引物及其互补引物，对SNP进行分型，同时研究了特异引物3?端碱基错配对等位基因特异PCR的影响，优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3?端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大；在等位基因特异PCR中，Mg2+、dNTP及Taq DNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3?端加上合适的错配碱基，并且优化其PCR反应体系，用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。     

用等位基因特异POR检测普通小麦（Triticum aestivum L．）的单核苷酸多态性单核苷酸多态性

【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系（RIL）的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料，研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列，在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3’端，设计等位基因特异引物及其互补引物，对SNP进行分型，同时研究了特异引物3’端碱基错配对等位基因特异PCR的影响，优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3’端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大；在等位基因特异PCR中，Mg^2＋、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3’端加上合适的错配碱基，并且优化其PCR反应体系，用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。     

菜心群体中 AUF2 基因的遗传变异及其与农艺性状的关联分析

【目的】通过检测 Auxin Up-regulated F-box protein2（AUF2）基因在菜心群体中的自然变异，挖掘其优异等位基因，为菜心分子辅助育种提供理论参考。【方法】采用 PCR 扩增后直接测序的方法，检测AUF2 基因在 156 份菜心种质材料中的自然变异，利用 Tassel 5.0 软件的混合线性模型（MLM）对 AUF2 基因的变异位点与菜心群体的株高、单株质量、最大叶长、最大叶宽、最大叶柄长和叶绿素含量（SPAD）等 6 个农艺性状进行关联分析，以期发现显著影响菜心农艺性状的变异位点，并确定其优异等位变异及单倍型。【结果】经测序分析，在 AUF2 基因的 2 996 bp 扩增区域内共检测到 34 个变异位点，构成 36 个单倍型，表现出较高的核苷酸多样性（π = 0.00503）和单倍型多样性（Hd = 0.780），其上游非编码区 1 498 bp 内含 26 个 SNP 和 2 个InDel 位点，编码区 960 bp 内含 5 个 SNP 和 1 个 InDel 位点，而下游非编码区 538 bp 范围没有检测到变异位点。中性检验显示，AUF2 基因在群体中的 Tajima’s D 值、Fu and Li’s D* 值和 Fu and Li’s F* 值均为正值，且显著偏离中性选择，可能是群体平衡选择的结果。经关联分析发现，4 个 SNP 位点与菜心的单株质量、最大叶长、最大叶宽和最大叶柄长等 4 个农艺性状呈显著相关性，其表型解释率在 5.04% ~ 6.52% 范围；4 个优异等位变异构成的单倍型 Hap2 能显著增加菜心的单株质量，极显著地提高最大叶柄长的长度。【结论】AUF2 基因在菜心群体中存在丰富的变异，对菜心的部分农艺性状有显著影响，其优异等位变异和单倍型将有利于菜心品种的遗传改良。     

小麦蛋白磷酸酶2A结构亚基基因TaPP2Aa的功能标记作图

 【目的】开发小麦抗旱相关蛋白磷酸酶结构亚基基因TaPP2Aa的功能标记并作图，为分子标记辅助选择抗逆育种提供依据。【方法】测序得到普通小麦及其野生近缘种TaPP2Aa的基因序列，分析其SNP位点差异，设计3对基因组特异引物和6对基因组内等位基因特异引物，利用中国春缺四体对TaPP2Aa进行染色体定位，利用RIL群体（Opata 85×W7984）和DH群体（旱选10号×鲁麦14）进行该基因的功能标记作图。【结果】TaPP2Aa定位于小麦第5同源染色体群上；TaPP2Aa-B位于RIL群体5B的标记区间Xwg909—Xgwm67，与2个标记的遗传距离分别为4.0 cM和3.6 cM，在DH群体5B染色体的标记区间Xgwm234—WMC363，与WMC363的遗传距离为7.5 cM；在2个遗传群体中与标记Xgwm67的距离分别为3.6 cM和11.4 cM。TaPP2Aa-D位于RIL群体染色体5D的标记区间Xcmwg770—Xbarc205，遗传距离分别为9.8 cM和10.0 cM。【结论】确定了TaPP2Aa所在的染色体位置，通过与DH和RIL 2个遗传作图群体中已有的抗逆主效QTL进行对比分析，明确了TaPP2Aa与小麦抗逆性状QTL具有遗传连锁关系，开发的功能标记可用于小麦抗逆性状的分子标记辅助选择。     

西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因连锁标记开发

【目的】开发与栽培西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因Fon-1紧密连锁的分子标记,为开展西瓜抗枯萎病分子辅助育种提供技术支撑。【方法】以栽培西瓜抗枯萎病品种Calhoun Gray为父本,感病品种Black Diamond为母本杂交获得的F2分离群体为供试材料,采用BSA法对Fon-1基因进行区间定位。依据11份栽培西瓜重测序信息,获取位于定位区间内的候选SNP位点。针对候选SNP位点设计CAPS/dCAPS标记,通过F2代分离群体和种质资源验证上述标记与Fon-1基因的连锁关系。【结果】通过BSA法,将Fon-1基因定位于1号染色体15 cM区间内。利用候选SNP位点信息,开发3个CAPS/dCAPS标记7716_fon、7419_fon和4451_fon,F2代分离群体以及164份西瓜育种材料验证显示,上述3个标记与Fon-1基因的连锁距离分别为0.8、1.0和2.8 cM。【结论】利用栽培品种Calhoun Gray的抗性遗传机制,开发的3个CAPS/dCAPS标记可以有效区分栽培西瓜对枯萎病菌生理小种1的抗病、感病性,为栽培西瓜品种枯萎病菌生理小种1抗性基因快速应用于栽培品种枯萎病抗性改良建立有效的技术手段。     

小麦TaGA20ox2基因的克隆及分析

 【目的】克隆小麦中的GA20-氧化酶基因并进行遗传定位,为深入研究小麦中的GA20-氧化酶基因作用机理奠定基础,同时为改良小麦的重要农艺性状提供理论依据。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,利用中国春缺失体以及国际作图群体对该基因进行遗传定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaGA20ox2的gDNA与cDNA序列,利用中国春缺失体材料将TaGA20ox2定位于3A、3B、3D染色体上,序列分析表明分别位于3A、3B、3D染色体上的TaGA20ox2-A1、TaGA20ox2-B1和TaGA20ox2-D1与水稻GA20ox2为直向同源基因,具有GA20ox2家族保守结构域;利用国际作图群体W7984×Opata85将位于3D上的基因TaGA20ox2-3定位于xfba330与xgwm664标记之间。【结论】分离获得小麦中分布于第三同源群的GA20ox2;分子标记结果结合QTL作图信息可以初步推测TaGA20ox2-3在小麦中可能是控制株高的基因。     

小麦抗秆锈病基因Sr22的SSR新标记

 【目的】利用微卫星技术筛选与Sr22紧密连锁的标记,从而应用于分子辅助育种选择与抗性种质基因检测分析。【方法】以抗秆锈病单基因系SWSr22与感病品种McN701为亲本杂交获得F1,单粒F1种子自交获得F2群体,选用中国流行小麦秆锈菌小种21C3CTH接种鉴定,进行遗传分析;利用分离群体集群分析法(BSA)对位于7A染色体的73对SSR引物进行多态性筛选,具有多态性的引物再通过SWSr22×McN701的F2抗感群体与F2﹕3家系的植株进行验证。【结果】该单基因系SWSr22对21C3CTH的抗性属于单位点显性遗传,并筛选到2对在亲本及F2抗感群体间揭示多态性的SSR引物Xwmc790和Xwmc633。通过对F2分离群体的分析表明,这2个标记与抗病基因Sr22紧密连锁,呈共显性,分布于该基因的同一侧,位于远着丝点处,与Sr22的遗传距离分别为2.8 cM和10.8 cM。【结论】这2个标记与抗病基因Sr22紧密连锁,经验证可用于小麦抗秆锈病分子标记辅助育种。     

基于重组自交系群体的小麦光温生产效率分析及新品系培育

【目的】通过对小麦重组自交系群体光温生产效率的分析,阐明小麦光温生产效率的遗传特点与生物学性状的关系,为高光温生产效率小麦品种的选育提供理论依据。【方法】利用重组自交系群体（RIL）,通过相关分析,检测高光温生产效率及其相关位点,并利用分子标记辅助选育高光温生产效率小麦新品系。【结果】小麦的光温生产效率与单株成穗数、穗粒数、平均灌浆速率、最大灌浆速率呈高度正相关,其中成穗数对小麦的光温生产效率贡献最大。光能生产效率受平均灌浆速率影响较大,而温度生产效率受最大灌浆速率影响较大。11个位点与光温生产效率相关,其中4个位点的贡献率在10%以上,分别为Xwmc167-2D、Xcwm23-2D、Xbarc218-3A和Xwmc326-3B。通过分子标记筛选到5个高光温效率的新品系,并且进行了验证。【结论】高光温效率小麦品种能很好地利用低温阶段的光温资源,形成较多分蘖,提高单株穗数和穗粒数。因而,在小麦新品种培育过程中,注重筛选单株成穗数多、穗粒数多和灌浆速度快的株系有利于提高小麦的光温生产效率和高产、稳产。利用同一群体可以将QTL分析与新品种选育相结合,是分子标记辅助选择的一条有效途径。     

水稻抗白叶枯病新基因的初步定位

【目的】通过与目前国际上已报道的抗白叶枯病基因进行分析比较,推测水稻抗源C4059含有1个新的抗白叶枯病基因,暂命名为Xa36(t)。将水稻抗源C4059的白叶枯病抗性转育到IR24遗传背景下,培育近等基因系并借助分子标记将其抗白叶枯病基因进行定位。【方法】以IR24/C4059的1个F3分离群体为材料,采用分离集团分析法,借助SSR、EST标记对Xa36(t)进行分子标记定位。【结果】找到13个与Xa36(t)连锁的标记,最近的4个标记RM2136、RM7443、RM1233和RM224与目标基因间的遗传距离分别为3.2、3.8、1.9和1.3cM。其中标记RM2136和RM7443位于染色体近端粒一侧,标记RM1233和RM224位于目标基因的另一侧。【结论】通过分子标记检测,将基因Xa36(t)定位于水稻第11染色体长臂末端附近。     

利用基因芯片技术进行小麦遗传图谱构建及粒重QTL分析

【目的】小麦遗传图谱是进行小麦染色体分析和研究表型变异的遗传基础。通过利用传统分子标记和现代基因芯片技术相结合,构建高密度遗传图谱,重点开展主要产量主要构成要素——粒重的初级基因定位,确定影响粒重的主效QTL位点,为开发粒重CAPS分子标记及在分子标记辅助育种提供依据和指导,并为利用小麦粒重次级群体进行精细定位和基因挖掘奠定基础。【方法】利用90 K小麦SNP基因芯片、DArt芯片技术及传统的分子标记技术,以包含173个家系的RIL群体（F_9：10重组自交系）为材料,构建高密度遗传图谱,并利用QTL network2.0进行了3年共4环境粒重QTL分析。【结果】构建了覆盖小麦21条染色体的高密度遗传图谱,该图谱共含有6 244个多态性标记,其中SNP标记6 001个、DArT标记216个、SSR标记27个,覆盖染色体总长度4 875.29 cM,标记间平均距离0.78 cM。A、B、D染色体组分别有2 390、3 386和468个标记,分别占总标记数的38.3%、54.3%和7.5%;3个染色体组标记间平均距离分别为0.80、0.75和0.80 cM。用该分子遗传图谱对4个环境下粒重进行QTL分析,检测到位于1B、4B、5B、6A染色体上9个加性QTL,效应值大于10%的QTL位点有QGW4B-17、QGW4B-5、QGW4B-2、QGW6A-344、QGW6A-137;其中QGW4B-17在多个环境下检测到,其贡献率为16%—33.3%,可增加粒重效应值2.30-2.97g,该位点是稳定表达的主效QTL。9个QTL的加性效应均来自大粒母本山农01-35,单个QTL位点加性效应可增加千粒重1.09—2.97 g。【结论】构建的覆盖小麦21条染色体的分子遗传图谱共含有6 241个多态性标记,标记间平均距离为0.77 cM。利用该图谱检测到位于1B、4B、5B、6A染色体上9个控制粒重的加性QTL,其中QGW4B-17是稳定表达的主效QTL位点,贡献率为16.5%—33%,可增加粒重效应值2.30—2.97 g。