安祖花ISSR-PCR反应体系的优化和确立

为建立适宜安祖花DNA的ISSR-PCR扩增体系,采用单因子试验对影响ISSR-PCR反应的各组分(Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度)进行了优化,确立了适合安祖花的条带清晰、多态性高、重复性好的最佳ISSR-PCR反应体系,即在20μL PCR反应体系中含有10×PCR Buffer 2.0μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、10 mmol/L dNTPs 0.8μL、5 U/μL Taq酶0.2μL、10μmol/L引物3.0μL、20 ng/μL模板2.0μL;并利用2条引物对15个安祖花品种进行了稳定性鉴定,为安祖花的遗传多样性分析及育种工作提供技术支持。     

葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与正交设计优化

建立和优化稳定的葡萄ISSR-PCR反应体系,为进一步开展葡萄遗传多样性研究和品种选优提供理论依据。运用改良的CTAB法从葡萄嫩叶中提取基因组总DNA,通过单因素试验分析d NTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、DNA模板用量、Taq DNA聚合酶用量等5个因素对葡萄ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响,并采用正交设计试验方法优化建立葡萄ISSR-PCR最佳反应体系。优化的最佳ISSR-PCR反应体系(20μL)为:10×PCR buffer、0.225 mmol/L d NTPs、Taq DNA聚合酶1.0 U、1.00μmol/L引物、2.75 mmol/L Mg2+、DNA模板30 ng。利用优化的ISSR-PCR反应体系能够扩增获得清晰、稳定的DNA条带,可用于后续的葡萄种质资源遗传多样性分析。     

贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的建立与条件优化

[目的]建立贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系,并对其条件进行优化.[方法]以贯叶连翘基因组DNA为模板,用L16(45)正交试验设计系统分析引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2浓度、dNTP浓度和模板DNA浓度5种因素对贯叶连翘ISSR-PCR反应扩增结果的影响.[结果]正交试验设计的方法可以用于贯叶连翘1SSR-PCR反应体系的建立,经过优化得到贯叶连翘ISSR-PCR反应体系的最佳条件为:20μISSR-PCR反应体系中含10×PCR buffer,Mg2+浓度1.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度50 U/ml,DNA浓度20 ng/μl,dNTP浓度250 μmol/L,引物浓度0.75 μmol/L.[结论]试验建立的贯叶连翘的ISSR-PCR反应体系重复性好、分辨率高,结果稳定可靠.     

珍稀濒危植物宝华玉兰ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立和优化宝华玉兰(Magnolia zenii Cheng)ISSR-PCR反应体系,采用正交试验和单因子试验方法对影响PCR扩增体系中的Mg~(2+)、d NTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定浓度的用量5个因子进行分析比较。结果显示,宝华玉兰ISSR-PCR 25μL反应体系中的5个因子最佳水平分别为DNA模板(20 ng/μL)3.5μL,引物(10μmol/L)1.25μL,Taq聚合酶(5 U/μL)0.2μL,Mg~(2+)(25 mmol/L)2.0μL,d NTPs(2.5 mmol/L)0.8μL。宝华玉兰ISSR-PCR反应的最优体系建立,为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。     

长春花ISSR-PCR 反应体系的正交优化

[目的]筛选最适的长春花ISSR-PCR反应体系。[方法]采用正交试验方法,对影响长春花ISSR-PCR反应体系的引物浓度、dNTP浓度、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶浓度和模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行正交试验,建立适合长春花ISSR-PCR的反应体系。[结果]长春花ISSR-PCR反应体系的最佳条件：引物浓度0.50μmol/L,dNTP浓度0.10 mmol/L,Mg2＋浓度3.00 mmol/L,Taq酶浓度0.75U/25μl,DNA模板浓度350 ng/25μl。采用该反应体系筛选出12对适合于长春花ISSR-PCR反应的引物。[结论]利用优化系统进行长春花的ISSR-PCR反应,可获得稳定性高、重复性好、背景清晰的电泳结果。     

老芒麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立并优化老芒麦ISSR-PCR反应体系和扩增程序,以期为探讨老芒麦种质资源的遗传多样性提供科学依据。[方法]采用正交设计试验和单因素试验相结合的方法对老芒麦的ISSR-PCR的反应体系进行构建和优化,对影响ISSR-PCR扩增效果的Taq酶、模板DNA的浓度、Mg2+、dNTP和引物浓度等因素进行优化,同时对退火温度、循环次数和延伸时间进行筛选。[结果]在25μl体系中各反应物的最适含量为:0.2 mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,1.50 U Taq DNA聚合酶,2.5μl 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2和40 ng模板DNA;循环次数和延伸时间分别是35次和90 s。[结论]该研究建立并优化了老芒麦ISSR-PCR反应体系,通过2份老芒麦种质对所优化体系得验证,结果显示体系稳定,可用于老芒麦种质资源遗传分析。     

白花蛇舌草ISSR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、d NTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度等5因素4水平条件对ISSR反应体系进行优化。白花蛇舌草ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为引物浓度0. 562 5μmol/L,Mg2+浓度2. 75 mmol/L,d NTPs浓度0. 375 mmol/L,DNA模板量60 ng,Taq DNA聚合酶1. 25 U,2. 0μL 10×Taq Buffer,其余用dd H_2O补齐。该试验建立并优化了白花蛇舌草ISSR-PCR反应体系,为白花蛇舌草种质资源遗传多态性的研究提供参考依据。     

海南省特有安诺兰ISSR体系的优化

以海南省特有安诺兰为基因组材料,采用改进的CTAB法提取安诺兰叶片中的基因组DNA,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各影响因子进行优化和筛选,建立适合海南安诺兰的ISSR-PCR反应体系:15μL PCR反应体积,10×PCR Buffer,200μmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶,40 ng模板DNA。     

野牛草ISSR-PCR反应体系的优化与建立

根据正交试验设计原理探索野牛草[Buchloe dactyloides(Nutt.)Engelm.]ISSR-PCR反应体系中各主要成分的最优化用量,对影响野牛草ISSR-PCR反应体系的主要因素[d NTP、Taq DNA聚合酶、引物(Primers)、Mg~(2+)的用量]进行优化,获得野牛草的ISSR-PCR最适反应体系为20μL的反应体系,包括引物(2.0μmol/L)4.0μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL、MgCl_2(25 mmol/L)1.6μL、d NTP(2 mmol/L)2.0μL和模板DNA(20 ng/μL)3.0μL。该优化体系的建立为利用ISSR分子标记进行野牛草种质资源遗传多样性研究、种质资源鉴定等奠定了基础。     

藤三七ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立和优化藤三七稳定ISSR-PCR反应体系和扩增程序。[方法]采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合的方法。[结果]适用于藤三七的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:10×buffer 2.5μl,dNTPs 0.15 mmol/L,Mg2+2.0mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.5μmol/L,DNA 100 ng。[结论]对于藤三七ISSR-PCR试验,一次正交试验完全可以建立满足要求的ISSR-PCR体系。     

甘蔗黑穗病菌培养基的筛选及基因组DNA分离技术

为了获得甘蔗黑穗病菌多态性分析所需的DNA,在对来自福建等6个省(区)的13个甘蔗黑穗病菌菌株单孢分离、培养基筛选的基础上,总结出了一种快速、简便提取甘蔗黑穗病菌DNA的方法,并通过凝胶电泳和RAPD(random amplified polymorphic DNA)对提取的DNA的质量进行了验证。结果表明,所提取的DNA纯度高,条带完整,适合于分子生物学操作。     

茄子RAPD分子标记体系的建立与优化

采用改良的CTAB法提取茄子基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,建立了茄子RAPD-PCR的最佳反应体系:20μL反应体系其中含25 mmol/L MgCl2 2.0μL1、0×PCR Buffer 2.0μL、10mmol/L dNTP 0.5μL5、U/μL Taq E 0.2μL0、.1μmol/L Primer 3μL1、0 ng/L模板DNA 3μL、灭菌双蒸水9.3μL。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,37℃退火1 min7,2℃延伸1.5 min4,5个循环;72℃延伸10 min后4℃保存。     

烟草DNA的提取与SRAP反应体系优化

以8个烤烟栽培品种为试验材料,对烟草基因组DNA的提取方法进行比较,并对建立烟草SRAP-PCR 反应体系的影响因子设置梯度试验.结果显示:改进的CTAB法能较好地满足烟草基因组DNA的提取,在20 μL SRAP-PCR的反应体系中,DNA模板40 ng、Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.2 μmol/L、Taq聚合酶1.5 U,8个烤烟品种的扩增多态性高,带型清晰,差异明显.     

椰子基因组DNA的提取及RAPD反应体系的优化

以椰子叶片为实验材料,探索了椰子基因组DNA的提取方法,并对影响RAPD反应的各因素进行了优化,建立了椰子的优化反应体系和程序。试验最终建立的椰子RAPD反应总体积为20μL,各有关成分的最佳浓度分别为Mg2＋2.5 mmol/L,Taq DNA0.75 U,dNTP 0.2 mmol/L,Primer 1μmol/μL,模板DNA2.5 ng/μL。PCR循环程序为：94℃预变性1.5min;94℃变性20 s,36℃退火20 s,72℃延伸45 s,35个循环;最后72℃延伸3 min。     

苎麻SSR反应体系的优化

[目的]优化苎麻SSR反应体系。[方法]以苎麻湘苎2号基因组DNA为模板,对其SSR反应体系中的部分影响因素进行探讨分析,并利用选定的7个苎麻品种基因组DNA为模板,对优化的SSR反应体系进行试验验证。[结果]在25μl SSR反应体系中,模板量为50 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs浓度为0.10 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U时,反应体系为最佳。利用该反应体系,对7个苎麻品种进行的SSR反应结果显示不同品种间DNA谱带多态性丰富,同时表明优化的反应体系重复性和稳定性良好。[结论]该研究结果为应用SSR技术进行苎麻种质资源的研究奠定良好的基础。     

大果油茶基因组DNA提取及ISSR反应体系建立

【目的】建立大果油茶的ISSR-PCR适宜扩增反应体系和程序,为其深入研究奠定基础。【方法】以大果油茶嫩叶片为供试材料,采用改良的SDS法提取其基因组DNA,并对其ISSR反应体系条件进行筛选及优化。【结果】提取的基因组DNA纯度和完整性较好,OD260/OD280值在1.8～2.0之间,DNA无降解现象,完全可以满足ISSR-PCR扩增要求。在25.0μLISSR-PCR反应体系中,各组分的适宜浓度配比为：40ng/μL模板DNA1.0μL、2.5mmol/LdNTPs2.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL、10μmol/L引物1.0μL、10×PCR Buffer2.5μL（含有Mg2＋）,加ddH2O至25.0μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性40s,52℃和53℃退火40s,72℃延伸90s,40个循环;最后72℃延伸7min。由此可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱。【结论】建立的ISSR-PCR反应体系可用于研究大果油茶遗传变异和多样性。     

毛白杨ISSR反应体系的建立及优化

为应用ISSR技术开展毛白杨遗传变异分析、辅助育种、品种鉴定、系统进化等研究,以(GTG)6为引物,通过单因子实验分别研究了退火温度、引物浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量对毛白杨ISSR-PCR反应的影响,建立并优化了适宜于毛白杨ISSR分析的扩增体系: 20 μL PCR反应体系,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 0.1% Trion X100, pH 9.0),1.5 mmol/L MgCl2,1.0 U Taq酶,10 ng模板DNA,0.2 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTP. 引物(GTG)6的最适退火温度为61℃.      

海带属配子体DNA提取及ISSR-PCR体系优化

为了建立一个重现性好、稳定性高,适用于海带属ISSR遗传分析的PCR反应体系,从海带属配子体材料中提取基因组DNA作为模板,应用正交设计试验对反应体系中各因子的不同浓度进行组合优化。结果显示：适用于海带ISSR扩增反应的最佳体系（20μL）为：1×PCR buffer,1.2 mmol/L Mg2＋,0.2 mmol/L d NTPs,1.0μmol/L ISSR引物,40 ng模板DNA,0.25 U Taq DNA聚合酶;扩增PCR程序为：95℃预变性3 min;95℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,共38个循环;最后72℃延伸10 min。在优化的海带ISSR反应条件下,扩增条带稳定,重现性好,为应用ISSR分子标记技术进行海带属遗传多样性研究和分子鉴定奠定了技术基础。     

利用正交设计优化芦笋SRAP反应体系

以芦笋（Asparagus offinalis L．）为材料，对影响SRAP—PCR扩增结果的因素dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2＋、引物、模板DNA进行了正交优化设计的研究。结果表明，适合芦笋SRAP—vcR析的最佳反应体系：20μL的反应体积中包括0．2mmol／LdNTPs0．4gL；1UTaqDNA酶1．0gL；1．5mmol／LMg2 1．2μg；上下引物各30ng，每个引物O．5此；60ng模板DNA1．1.0μL；10Buffer2．0凼无菌双蒸水13．4此。为今后利用SRAP标记技术研究芦笋的遗传多样性奠定基础。     

珙桐基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的优化

采用改良的CTAB法提取珙桐基因组DNA,并采用正交试验设计方法优化其ISSR-PCR反应体系。结果表明：改良CTAB法提取基因组DNA的质量符合ISSR-PCR扩增反应的要求。最佳反应体系为：20μL反应液中含有2.0μL10×buffer、2.75 mmol/L Mg^2＋、0.125 mmol/L dNTPs、0.7μmol/L引物、0.75 UTaq酶和40 ng模板;PCR反应参数为：94℃5 min;94℃30 s,53.2℃45 s,72℃1 min,共40个循环;72℃7 min。