小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-A单核苷酸多态性分析及其定位

 【目的】小麦果聚糖合成酶基因6-SFT是果聚糖合成过程中的关键酶基因,研究6-SFT-A的多态性,分析其与小麦苗期抗旱性的关系,并进行遗传定位。【方法】以苗期抗旱性不同的30份六倍体小麦和4份小麦A基因组供体种乌拉尔图小麦为材料,通过直接测序分析6-SFT-A的单核苷酸多态性（SNP）及其与抗旱性的关系;开发基因分子标记,利用RIL群体（偃展1号×内乡188）对该基因进行遗传定位。【结果】在30份六倍体小麦材料中检测到14个核苷酸多态性位点,包括13个SNP和1个InDel,平均234 bp检测到一个多态性位点,仅在1 727和1 781 bp 2个位点检测到非同义突变;在4份乌拉尔图小麦中检测到28个SNP和4个InDel,其频率明显高于普通小麦。该基因的内含子1、2、3和外显子3为变异富集区,其它区域变异较小,外显子2变异最小,π值为0。34份材料分为3种单倍型,HaplⅠ主要包括中等抗旱材料和水敏感材料,Hapl Ⅲ中主要包括强抗旱材料和中等抗旱材料。利用RIL群体将该基因定位于染色体4A的标记Xcwm-27与Xwpt688之间,遗传距离分别为5.3和7.9 cM。【结论】单倍型分析表明,小麦果聚糖合成酶基因6-SFT-A单倍型与小麦苗期抗旱性有一定的相关性。     

小麦抗旱相关基因TaCRT-D单核苷酸多态性分析

 【目的】钙网蛋白（CRT）是细胞内质网膜上的钙结合蛋白,参与多种细胞功能的调节。研究小麦钙网蛋白基因TaCRT-D单核苷酸多态性,并分析其与抗旱性的关系。【方法】以苗期抗旱性不同的37份六倍体普通小麦和3份普通小麦D基因组供体种粗山羊草为材料,通过直接测序分析TaCRT-D基因的单核苷酸多态性（SNP）及其与抗旱性的关系。【结果】TaCRT-D基因DNA长度为4 001 bp,在长达160 040 bp的核苷酸序列中共检测到105个单核苷酸变异位点,包括84个SNP和21个InDel,二者出现的频率分别为1/1 905和1/7 621,编码区的核苷酸多样性值（π）小于非编码区,说明编码区所承受的选择压力较大,遗传变异小于非编码区。单倍型分析表明,40份供试材料分为8种单倍型,其中单倍型H1中11份材料包括4份中等抗旱材料和7份干旱敏感材料;单倍型H3、H4和H7既有抗旱性强的材料也有干旱敏感材料;单倍型H5只包括3份小麦D基因组供体种材料。【结论】普通小麦TaCRT-D基因中SNP频率较低,TaCRT-D基因单核苷酸多态性与小麦苗期抗旱性之间没有明显的对应关系。     

用等位基因特异POR检测普通小麦（Triticum aestivum L．）的单核苷酸多态性单核苷酸多态性

【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系（RIL）的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料，研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列，在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3’端，设计等位基因特异引物及其互补引物，对SNP进行分型，同时研究了特异引物3’端碱基错配对等位基因特异PCR的影响，优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3’端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大；在等位基因特异PCR中，Mg^2＋、dNTP及TaqDNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3’端加上合适的错配碱基，并且优化其PCR反应体系，用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。     

用等位基因特异PCR检测普通小麦（Triticum aestivum L.）的单核苷酸多态性

 【目的】以2份六倍体小麦Opata85和W7984及其重组近交系（RIL）的111个株系和3份小麦二倍体野生近缘种为材料，研究用等位基因特异PCR检测普通小麦中单核苷酸多态性的方法。【方法】利用直接测序的方法检测2份六倍体小麦和3份小麦二倍体野生近缘种TaDREB1基因的DNA序列，在B基因组上发现了2个SNPs。以其为3?端，设计等位基因特异引物及其互补引物，对SNP进行分型，同时研究了特异引物3?端碱基错配对等位基因特异PCR的影响，优化了PCR反应体系。【结果】等位基因特异引物3?端不同位置的碱基错配及不同类型的碱基错配对PCR结果影响较大；在等位基因特异PCR中，Mg2+、dNTP及Taq DNA聚合酶的用量均大于普通PCR。【结论】只要在等位基因特异引物3?端加上合适的错配碱基，并且优化其PCR反应体系，用等位基因特异PCR方法检测六倍体小麦中的单核苷酸多态性是可行的。     

小麦抗旱相关基因TaGSTF6的多态性

【目的】研究TaGSTF6基因多态性与抗旱性的关系。植物谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）是一类重要的受逆境胁迫诱导表达的酶类，能减少干旱等逆境胁迫导致的体内活性的氧积累，在植物的抗旱反应中发挥重要作用。【方法】以86份抗旱性不同的普通小麦品种和7份粗山羊草为材料，检测TaGSTF6基因的核苷酸序列长度及碱基组成多态性，并预测氨基酸序列多态性。【结果】Northern分析结果表明，小麦幼苗中TaGSTF6基因受水分胁迫诱导表达。序列多态性分析发现在长达113.6 kb的核苷酸序列中有47个单核苷酸变异位点，其中23个SNP，24个InDel，二者的频率分别为1SNP/4 940bp和1InDel/4 734bp，粗山羊草中SNP和InDel出现的频率明显高于普通小麦；仅在11份材料中预测到氨基酸序列多态性。根据核苷酸序列变异可能导致的氨基酸变异把基因编码区的变异分为两类：核苷酸转换或颠换导致的单个氨基酸变异；碱基缺失导致的移码突变或翻译提前终止，其中大多数变异属于移码突变。【结论】尽管小麦基因组庞大，重复序列多，但在功能基因TaGSTF6中SNP的分布频率非常低；虽然TaGSTF6受水分胁迫诱导表达，但其结构多态性分析未能揭示其多态性与小麦抗旱性之间的直接关系。     

小麦TaSnRK2.10的多态性及与农艺性状的关联

【目的】蔗糖非发酵蛋白激酶（SnRK）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物信号传递途径中发挥着重要作用。研究小麦TaSnRK2.10的多态性,开发其功能标记,并进行标记-表型性状关联分析,为利用分子标记进行遗传改良和种质创新提供依据。【方法】以30份多态性较高的六倍体普通小麦及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料,通过测序分析TaSnRK2.10-A的序列多态性;利用中国春缺-四体材料对该基因进行染色体定位;利用RIL群体（偃展1号×内乡188）对基因进行遗传定位;根据TaSnRK2.10-A序列多态性,开发分子标记,以262份普通小麦构成的自然群体为材料分析基因单倍型与表型性状的关联特性。【结果】克隆了小麦TaSnRK2.10的A、D基因组序列,在由30份多态性较高的小麦材料组成的自然群体中,没有检测到来自D基因组的TaSnRK2.10-D序列多态性;TaSnRK2.10-A全长4 688 bp,包括启动子1 934 bp、5′-UTR 343 bp、编码区2 319 bp及3′-UTR 92 bp。在基因全长序列中共检测到15个SNP、2个InDel。其中,启动子区有8个SNP,5′-UTR有2个,编码区有5个。位于编码区的5个SNP中,2个存在于外显子,其中一个是非同义突变。2个InDel均位于编码区。根据序列多态性分别设计了启动子区的分子标记PM1和PM2,以及基因编码区的分子标记GM1和GM2。利用中国春缺-四体材料将TaSnRK2.10-A定位于小麦染色体4A,利用RIL群体将TaSnRK2.10-A定位在染色体4A的标记Xwpt7001和WMC48之间,与2个侧翼标记的遗传距离分别为5.1 cM和25.7 cM。利用开发的4个分子标记,将自然群体的262份材料分为4种单倍型,分别与千粒重、单株穗数和每穗小穗数显著相关或极显著相关,HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型。4 184 bp位点为C时,为高千粒重的优异等位变异。【结论】小麦TaSnRK2.10-A位于染色体4A。HapⅡ和HapⅢ是提高千粒重的优异单倍型,HapⅣ是提高单株穗数的优异单倍型,4 184 bp位点的胞嘧啶（C）是优异等位变异。     

紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性分析

[目的]磷脂:二酰甘油脂酰转移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步酰基化反应的关键酶之一,研究紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性,旨在分析该基因多态性与紫苏种子油脂含量之间的关系。[方法]以脂肪酸含量不同的7个紫苏品种为试材,通过直接测序法分析PfPDAT基因cDNA全长序列的单核苷酸多态性及其与油脂含量的关系。[结果]在所测总长度为14 679bp的核苷酸序列中,共检测到9个SNP和2个InDel,单核苷酸多态性频率分别为1/1 631bp和1/7 340bp,其中编码区含2个SNP,非编码区为7个。编码区和非编码区发生SNP的频率分别为1/5 439bp和1/543bp。根据PfPDAT基因序列多态性将供试紫苏材料分为不同的单倍型,单倍型H1和H2中都包含有油脂含量较高和含量较低的材料。[结论]PfPDAT基因的单倍型分类与紫苏油脂含量之间没有显著相关性,同时也反映了植物种子油脂合成的复杂性。     

小麦脱水应答转录因子(TaDREBs)的序列分析及TaDREBs基因在部分小麦品种的分布

[目的]了解TaDREBs基因之间的进化关系以及TaDREBs在小麦中的存在情况。[方法]用4种引物TaDREBs(TaDREB1,2,3,5)在35种小麦品种中进行扩增,用PowerBlast1.2.0等4个分析软件对小麦脱水应答转录因子TaDREBs(TaDREB1,2,3,5,6)的序列进行比较,并建立进化树。[结果]各个TaDREBs基因之间的同源性有较大的差异,TaDREB1与TaDREB6的同源性高达87%,其余各转录因子的同源性在44%~53%之间,表明这类基因在干旱应答中所起的作用并不相同。在所有供试小麦品种中扩增到TaDREB5基因,扩增条带在298 bp左右,而其他几个TaDREBs基因在少数小麦品种没有扩增到。[结论]TaDREB5基因可能是小麦耐旱相关重要的基因,它的多态性可能对揭示小麦抗旱机理有重要作用。     

小麦转录因子基因W16的功能标记作图和关联分析

【目的】开发小麦DREB转录因子基因W16的功能标记,进行遗传作图,并结合表型性状关联分析,为利用分子标记进行小麦遗传改良提供依据。【方法】以六倍体普通小麦及其野生近缘种的二倍体和四倍体为材料,克隆W16的DNA序列;根据序列多态性设计分子标记;利用中国春缺四体材料对基因进行染色体定位,用DH群体（旱选10号×鲁麦14）进行精细定位并作图;以154份六倍体普通小麦材料构成的自然群体分析表型性状与基因单倍型的关联特性。【结果】利用中国春缺四体材料先将W16定位在1A染色体上。后利用DH群体将W16定位于染色体1A的CWM517和WMC20标记之间,距左、右标记的遗传距离分别为7.8 cM和19.4 cM。在小麦自然群体中共检测到W16的3种单倍型,分别与单株穗数、穗粒数、每穗小穗数和籽粒饱满度关联。【结论】确定了W16所在的染色体位置,鉴定出HapⅡ为增加单株穗数和籽粒饱满度的优良单倍型,HapⅢ为提高穗粒数的优良单倍型,该基因的功能标记和关联分析结果为小麦分子育种提供了重要信息。     

16个高丛越橘品种VcCBF基因的单核苷酸多态性(SNP)分析

CBF是与植物抗寒、抗旱等抗逆性相关的一种转录因子,在植物抵抗逆境过程中发挥重要作用.以16个高丛越橘品种为试材,采用直接测序法克隆VcCBF基因,共克隆到94个非重复序列,对这些序列进行单核苷酸多态性分析,测序总长度63732 bp,共发现103个SNP,单核苷酸多态性发生频率为1/619 bp,核苷酸多态性值(Pi)为0.01274.在103个SNP中,单态突变位点为52个,简约信息位点为51个,其中双突变为50个,三态突变为1个.通过碱基转换方式的分析发现,转换共83个,颠换19个,转换与颠换的发生比率为4.37 1.通过单倍型分析发现在16个越橘品种中VcCBF基因存在5种单倍型.     

油菜β-CT亚基编码基因accD的SNPs分析及其分子进化

以含油量不同的32份甘蓝型油菜自交纯合系为材料,用直接测序法筛查β-CT亚基的accD编码基因DNA序列的单核苷酸多态性,包括98%的编码区序列共1380 bp。在32份材料中只在材料18和20两个材料中发现了一个相同的SNP,SNP频率为1/1380,单倍型多态性指数Hd=0.121;核苷酸多态性π=0.00009,θ=0.00018。Tajima’s D值为不显著负值,Fu&Li’s检测,各个参数均为不显著正值,Z检验结果中(dN-dS)值也为不显著正值,说明accD基因没有偏离中性进化。系统发育树表明,accD基因在所选的32个油菜材料中是高度保守的,与拟南芥的序列相似度高达95.7%,说明accD基因在物种间也是高度保守的。暗示其在种子油脂合成过程中起着不可替代的作用,此外说明,仅用β-CT亚基编码基因的单核苷酸多态性还不能解释含油量复杂的表现型,还需在更大的群体资源中扩增accD编码基因和其它亚基编码基因进行单核苷酸多态性与含油量表型的相关性研究。     

高灌蓝莓CBF基因的单核苷酸多态性分析

本研究以21个高灌蓝莓品种为试材,克隆VcCBF基因,测序后分析其单核苷酸多态性(SNP),共克隆到123个非重复序列,发现120个SNP位点,单核苷酸多态性发生频率为1/695bp,核苷酸多态性值(Pi)为0.01251。在120个SNP位点中,单态突变位点62个;简约信息位点58个,其中双突变55个,三突变3个。对其碱基替换方式进行分析发现,转换91个,颠换26个,转换与颠换的发生比率为3.5∶1。通过单倍型分析发现,21个蓝莓品种的VcCBF基因存在5种单倍型。     

Quantitative trait loci analysis for root traits in synthetic hexaploid wheat under drought stress conditions

Synthetic hexaploid wheat(SHW), possesses numerous genes for drought that can help breeding for drought-tolerant wheat varieties. We evaluated 10 root traits at seedling stage in 111 F9 recombinant inbred lines derived from a F2 population of a SHW line(SHW-L1) and a common wheat line, under normal(NC) and polyethylene glycol-simulated drought stress conditions(DC). We mapped quantitative trait loci(QTLs) for root traits using an enriched high-density genetic map containing 120 370 single nucleotide polymorphisms(SNPs), 733 diversity arrays technology markers(DArT) and 119 simple sequence repeats(SSRs). With four replicates per treatment, we identified 19 QTLs for root traits under NC and DC, and 12 of them could be consistently detected with three or four replicates. Two novel QTLs for root fresh weight and root diameter under NC explained 9 and 15.7% of the phenotypic variation respectively, and six novel QTLs for root fresh weight, the ratio of root water loss, total root surface area, number of root tips, and number of root forks under DC explained 8.5–14% of the phenotypic variation. Here seven of eight novel QTLs could be consistently detected with more than three replicates. Results provide essential information for fine-mapping QTLs related to drought tolerance that will facilitate breeding drought-tolerant wheat cultivars.     

Sequence Polymorphisms and Phylogenetic Relationships of hina Gene in Wild Barley from Tibet, China

The hina gene encodes a HINA protein in seeds of barley (Hordeum vulgare), which was known to affect the grain hardness. 171 hina gene sequences from Tibetan wild barley accessions and worldwide were characterized. Across 1 452 nucleotides of 171 hina genes, 152 SNPs were detected, giving an average frequency of one SNP per 9.5 bases. There were 93 singleton variable sites (the nucleotide polymorphism only observed in a single accession), 59 polymorphic sites (the polymorphisms found in two or more accessions) and 8 indels. A total of 18 haplotypes were defined, and most of the barley accessions shared one gene haplotype. H. spontaneum had a wider haplotype distribution. Through the analysis of median-joining network of the 18 haplotypes, 4 haplotype groups were found, which were testified by neighbor-joining tree based on the complete sequence alignment. Extremely low level of hina gene diversity was observed in Tibetan wild barley accessions, indicating that Tibet is unlikely a center of origin for cultivated barley.     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGFI基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点。应用RFLP、CRS—RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布。结果表明：（1）IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1317bp、712bp和1941bp;（2）在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G—A突变;内含子3的第40个碱基为一个“A”的插入-缺失突变,第307位为C—T突变,683位是G—A突变;内含子4上的696碱基处有一个20bp的插入-缺失突变,在1563位为G—A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;（3）内含子1上SNPG1070A的A等位基因能为HindIII限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型。根据内含子1上SNPG208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成TaqI酶切位点,建立CRS—RFLP检测方法。内含子4上SNPG1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型。试验结果显示,RFLP、CRS—RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;（4）在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNPG1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低。     

团头鲂MHCⅡ α基因的SNP位点开发、鉴定及与抗病性状关联分析

用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染团头鲂(Megalobrama amblycephala)区分抗病和易感组,通过PCR扩增及测序在MHCⅡα基因上筛选单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms,SNP),利用高分辨率熔解曲线法和限制性内切酶酶切法对SNP进行分型,分析其多态性及与抗病性状之间的关系。在MHCⅡa基因上共筛选出35个候选SNP位点,占MHCⅡa基因总碱基的1.45%,包含30个转换位点、5个颠换位点。其中外显子部分有16个,内含子部分7个,5′非编码区有1个,3′非编码区有11个。有13个SNP位点位于编码区,占总氨基酸位点的5.56%,位于839bp的T/A颠换和1 663bp的A/G转换是无义突变,其余11个SNP位点为有义突变。α1结构域的SNP位点分别占总碱基和总氨基酸位点的4.88%和10.98%,明显高于α2结构域的1.08%和3.22%。MHCⅡα基因的21个抗原结合位点(peptide binding region,PBR)中,有4个位点变异,变异率为19.05%;而non-PBR的变异率仅为8.20%(5/61)。用SPSS软件对分型成功的5个SNP位点在易感和抗病组各100尾中的基因型频率和等位基因频率进行了统计。通过卡方检验分析发现位于1 395bp(T/A)位点的基因型频率和等位基因频率在易感和抗病组中差异极显著,位于221bp(G/T)和1 859bp(G/T)位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗病组中差异显著。本研究结果表明团头鲂MHCⅡα基因的多态性和抗细菌性败血症性状显著关联。     

Sequence Polymorphisms and Phylogenetic Relationships of hina Gene in Wild Barley from Tibet, China

The hina gene encodes a HINA protein in seeds of barley （Hordeum vulgare）, which was known to affect the grain hardness. 171 hina gene sequences from Tibetan wild barley accessions and worldwide were characterized. Across 1 452 nucleotides of 171 hina genes, 152 SNPs were detected, giving an average frequency of one SNP per 9.5 bases. There were 93 singleton variable sites （the nucleotide polymorphism only observed in a single accession）, 59 polymorphic sites （the polymorphisms found in two or more accessions） and 8 indels. A total of 18 haplotypes were defined, and most of the barley accessions shared one gene haplotype. H. spontaneum had a wider haplotype distribution. Through the analysis of median-joining network of the 18 haplotypes, 4 haplotype groups were found, which were testified by neighbor-joining tree based on the complete sequence alignment. Extremely low level of hina gene diversity was observed in Tibetan wild barley accessions, indicating that Tibet is unlikely a center of origin for cultivated barley.     

虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析.结果表明:虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1491 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸;其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性,即核苷酸发生了A→G突变.关联分析结果表明,该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性(P＜0.05).本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列并进行了SNPs分析,研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考.