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相似文献
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1.
根据编码牛种布鲁氏菌外膜蛋白(OMP-2)基因的核苷酸序列设计1对PCR引物,并对PCR扩增条件进行优化,建立了快速检测布鲁氏菌病病原的PCR方法。特异性检测表明,该引物对牛种、羊种、猪种布鲁氏菌制备的模板DNA均能扩增出193bp目的基因片段,但不能扩增大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠结肠炎耶氏菌(0:9型)的目的基因片段;敏感性检测显示,乳样的检测灵敏度达50cfu/mL、纯化的布鲁氏菌DNA检测灵敏度达1.5pg,可重复性和稳定性十分理想。可见,该布鲁氏菌病病原PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,能为快速诊断布鲁氏菌病提供技术支撑。  相似文献   

2.
桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。本研究针对柱枝双孢霉(Cylindrocladium scoparium)菌株的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因上保守序列极强的靶基因区域序列进行特异性引物BT-S-1/BTA-1的设计和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的合成,分别利用常规PCR和巢式PCR技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较,同时本研究也对所建立的巢式PCR用于桉树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。试验结果表明:利用beta-tubulin基因序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A对全部供试菌株进行扩增,所有参试菌株均可扩增出1条约500bp的条带;而单独使用特异性引物BT-S-1/BT-A-1进行常规PCR扩增时仅病原菌能够扩增出1条148bp的明亮条带;当利用通用引物作为第1轮引物,以稀释10倍后的第1轮PCR产物作为第2轮PCR模板,利用特异性引物进行巢式PCR扩增时,也可扩增出上述148bp大小的明亮条带,且巢式PCR的扩增效果较常规PCR具有明显的视觉优越性;灵敏度检测试验表明,巢式PCR的灵敏度可检测到5fg/μL,较常规PCR可以扩增出的极限(DNA质量浓度为5pg/μL)至少提高了103倍;田间时效检测试验也说明巢式PCR较常规PCR具有更高的准确度和灵敏性,可达到田间检测的要求。本研究建立的巢式PCR检测技术可有效应用于桉树焦枯病的早期诊断。  相似文献   

3.
将hrpB2基因作为检测靶标,根据hrpB2基因设计了1对特异性引物HB2F2/HB2R2,用此特异引物从瓜类细菌性果斑病菌菌株中扩增出290 bp的特异性片段,而其余参试菌株和甜瓜组织的PCR反应结果为阴性,灵敏度试验证明可以检测到103CFU/ml靶标菌体。对市售的17个品种的甜瓜种子进行PCR检测,其中4个品种检测出携带有瓜类细菌性果斑病菌。将hrp基因作为靶标,为快速检测瓜类细菌性果斑病菌提供了新的方法。  相似文献   

4.
研究应用多重PCR方法检测单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogen,LM)的三种特异性毒力基因iap、hly、Inl,相应扩增片段分别为457 bp、745 bp、562 bp。引物特异性和菌株特异性试验均表明3对引物具有很高的特异性。在对食品中LM进行检测时,整个检测过程在16 h内,检测灵敏度达到2 cfu·g-1样品,检测阳性结果与GB 4789.30-2010方法的完全一致。我们的试验结果表明建立的多重PCR是LM检测的一种快速、灵敏和特异性强的检测方法。  相似文献   

5.
为实现贝西滑刃线虫的高效、准确鉴定,根据贝西滑刃线虫核糖体28SrRNA-D2/D3片段的保守区域设计了特异性引物,并结合植物寄生线虫通用引物作为内标,构建了贝西滑刃线虫的一步双重PCR检测体系。结果表明:特异性引物GU-F/GU-R对贝西滑刃线虫具有高度的特异性,扩增出245bp的特异性目标片段,有效检测灵敏度可达0.125ng/μL线虫DNA模板量。该方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,适用于贝西滑刃线虫的快速检测。  相似文献   

6.
目的:建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法。方法:优化金黄色葡萄球菌DNA提取方法并设计基因特异性引物,采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)编码基因,验证检测的特异性及灵敏度。结论:所检出的金黄色葡萄球菌在497bp处出现特异片段,该方法具有较高的敏感性和特异性,可作为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的手段。  相似文献   

7.
三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Rat sarcoma)相关的基因,在酵母中,该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。为了研究以Ypt1基因为分子靶标的致病疫霉菌(P.infestans)检测技术,比较了30种卵菌Ypt1基因的序列,以该序列为靶标设计了1对针对P.infestans的特异性PCR引物Pi1/Pi2。试验结果表明,在供试的55种不同疫霉菌和真菌的144个菌株中,利用这1对引物只能从P.infestans基因组DNA中分别扩增出1条分子量为369 bp的特异性条带,这1对引物的检测灵敏度为100 pg。以疫霉菌Ypt1通用引物Yph1F/Yph2R结合这1对特异引物进行套式PCR扩增,使引物Pi1/Pi2的检测灵敏度提高了10倍,检测到10 pg的基因组DNA。通过套式PCR,引物Pi1/Pi2对游动孢子和卵孢子的检测灵敏度分别为3个游动孢子和1个卵孢子;以Pi1/Pi2引物,分别采用单轮PCR和套式PCR可检测马铃薯发病组织和病田土壤的致病疫霉。以上结果证明Ypt1基因适合作为疫霉菌分子检测靶标。采用以这1对特异引物建立的以PCR技术为基础的分子检测方法,可对田间土壤和发病植物组织中的P.infestans进行快速、灵敏的检测。  相似文献   

8.
牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用   总被引:1,自引:0,他引:1  
参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中1对能够扩增不同基因型BVDV 5′UTR片段(288 bp),另2对分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5′UTR片段(195 bp和116 bp)。扩增片段大小与预计片段一致。对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的RT-nPCR检测方法。敏感性试验表明,敏感性为10-2TCID50/mL。特异性试验表明,对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。通过对新疆部分地区无BVD临床症状的牛场208份奶牛血样检测,阳性率为50.43%,表明该方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可以作为BVDV隐性感染临床诊断的有效方法。  相似文献   

9.
 水稻细菌性条斑病是我国水稻上的检疫性病害之一。设计并筛选出特异性引物对Xoc2071F/Xoc2071R(Xoc2071),其扩增片段大小为329bp,利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法进行水稻细菌性条斑菌的实时荧光PCR检测。结果表明,引物对Xoc2071能特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其他菌种不产生荧光信号。检测的灵敏度是2.25fg/μL质粒DNA和1.0×102cfu/mL的菌悬液,相当于1个细菌的基因,比常规PCR电泳检测的灵敏度高约100倍。此实时荧光PCR可以检测到仅需10g的带菌种子上目标菌的存在。  相似文献   

10.
为建立快速并能同时检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌3种奶牛隐性乳房炎致病菌的方法,根据无乳链球菌16S rRNA基因、金黄色葡萄球菌NUC耐热基因、绿脓杆菌ETA基因序列并参考文献各合成一对特异性引物,通过对PCR反应各项参数的调整优化,建立多重PCR检测体系,并同时进行灵敏性试验和特异性试验。结果显示:该检测方法可以同时扩增出无乳链球菌270 bp、金黄色葡萄球菌153 bp和绿脓杆菌375 bp的特异性片段以及细菌16S rRNA 1 500 bp的通用片段,而对于其他的6种病原菌只能扩增出1 500 bp的通用片段,具有较强的特异性。三种特异性引物扩增条带与GenBank上的细菌基因序列同源性为99%。增菌培养24 h,该体系对无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的最低灵敏度分别为8×104、4×104、1.5×105 CFU·mL-1。本研究建立的检测方法能够完成无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的快速检测,对于生产上奶牛隐性乳房炎的鉴别诊断和快速检测具有重大意义。  相似文献   

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