巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶(UBC)基因,该基因长653 bp,最长开放阅读框504 bp,预测编码蛋白包含167个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC14(At3g55380)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在花药中表达最低。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC14可能在巴西橡胶树死皮、乙烯和茉莉酸反应中发挥作用。     

巴西橡胶树HbRALF34的克隆及表达分析

依据橡胶树胶乳转录组数据,利用RT–PCR技术鉴定了一个快速碱化因子(rapid alkalinization factor,RALF)家族基因cDNA序列。该cDNA长度为767 bp,开放阅读框长度为411 bp,编码136个氨基酸。序列比对显示该RALF基因与AtRALF34有较高相似性,因而命名为HbRALF34。以热研7–33–97无性系橡胶树为材料,采用实时荧光定量PCR对不同组织及乙烯、茉莉酸、伤害、过氧化氢、高盐、低温、干旱等处理下HbRALF34的表达模式进行分析。结果表明:HbRALF34在橡胶树叶片、花、树皮以及胶乳中均有表达,其中胶乳中表达量最高;与健康橡胶树相比,HbRALF34在死皮橡胶树胶乳及树皮中的表达量显著上调;乙烯、茉莉酸、过氧化氢及伤害处理能诱导该基因表达,而低温、干旱及高盐处理则抑制该基因表达,表明HbRALF34可能参与橡胶树的信号传导、产排胶调控以及胁迫响应。     

橡胶树乳管细胞GPPS基因的克隆与表达分析

【目的】克隆橡胶树乳管细胞短链异戊烯基合酶(GPPS)基因,分析其表达特性和编码蛋白的相互作用,为解析该类基因在天然橡胶和萜类合成中的作用提供理论参考。【方法】采用逆转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(RACE)从橡胶树乳管细胞胶乳中克隆GPPS基因(HbGPPS1和HbGPPS2),利用生物信息学分析其编码蛋白的特性;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测HbGPPS1和HbGPPS2在树皮和胶乳中的组织表达特异性、在不同橡胶树品系中的表达模式及其对割胶和外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理的响应模式,并在原核细胞中进行表达分析;通过酵母双杂交技术检测HbGPPS1和HbGPPS2蛋白的相互作用关系。【结果】从橡胶树乳管细胞乳胶中克隆获得HbGPPS1和HbGPPS2基因,其中HbGPPS1基因编码框长度为1248 bp,编码415个氨基酸,蛋白分子量为45.9 kD,理论等电点为6.77;HbGPPS2基因编码框长度为1239 bp,编码412个氨基酸,蛋白分子量为45.6 kD,理论等电点为6.77。二者的核苷酸序列相似性为89%,且编码蛋白均含有2个典型的异戊烯基转移酶活性结构域DDXXD(D),定位于叶绿体和线粒体。HbGPPS1蛋白自身及其与HbGPPS2蛋白均能形成较弱相互作用的二聚体。qRT-PCR检测结果显示,HbGPPS1和HbGPPS2基因在胶乳中的表达量高于树皮,但均以HbGPPS2基因表达量较高,表明二者表达存在组织特异性。经MeJA处理后橡胶树胶乳中HbGPPS1和HbGPPS2基因表达量较对照高,即外源MeJA可促进内源茉莉酸的合成,激活乳管细胞内的茉莉酸信号从而上调HbGPPS1和HbGPPS2基因表达。在5个橡胶树栽培品系中,HbGPPS2基因的表达量均明显高于HbGPPS1基因,且与PR107、热研7-20-59、RRIM600和热研7-33-97干胶含量趋势一致,但二者仅在热研8-79和热研7-33-97的表达模式存在差异。HbGPPS2基因能在大肠杆菌中成功表达。【结论】HbGPPS2基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶和萜类合成的主效基因,而HbGPPS1基因可能是功能冗余基因。HbGPPS2和HbGPPS1基因在不同橡胶树品系中的表达模式与各品系干胶含量呈正相关,可用作为干胶含量评估的筛选标记。     

巴西橡胶树HbNTL2基因的克隆和表达分析

利用RT–PCR和实时荧光定量PCR技术,对巴西橡胶树膜结合转录因子HbNTL2进行克隆和表达,并通过酵母试验进行转录激活功能分析。结果表明,HbNTL2基因的开放阅读框为1 380 bp,编码一个由459个氨基酸组成的蛋白,该蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC001亚族;在第6～172位氨基酸之间含有典型的NAC结构域,第433~453位氨基酸具有跨膜结构域,是膜结合NAC转录因子;HbNTL2具有转录激活功能,转录激活区在C–末端;HbNTL2在叶片的表达高于在橡胶树的其他部位,受割胶、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)处理以及低温胁迫诱导。综合分析结果表明,HbNTL2可能参与调控巴西橡胶树的生长发育和胁迫应答过程。     

巴西橡胶树HbMYBs转录因子的克隆及表达分析

通过同源序列比对,笔者克隆了巴西橡胶树5个与抗逆相关的HbMYBs基因,根据其与拟南芥同源基因的相似性,分别命名为HbMYB15,HbMYB21,HbMYB24,HbMYB35和HbMYB75,其阅读框长度分别为651,984,999,1 095,933 bp。生物信息学分析结果表明,这5个HbMYBs基因编码的蛋白序列都包含MYB家族结构域,属于R2R3类MYB转录因子。酵母自激活实验结果显示这5个HbMYBs蛋白均具有转录活性,具有转录因子特征。荧光定量PCR分析结果表明,创伤、乙烯处理和茉莉酸处理对这5个HbMYBs基因中有不同程度的诱导作用,这些基因有可能参与乙烯和茉莉酸信号相关的植物防御应答。     

一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆和表达特性分析

 【目的】从橡胶树中克隆Glutathione-S-transferase（GST）基因的cDNA和基因组DNA，进行序列、结构和系统进化分析，研究胁迫条件和激素处理下的表达谱。【方法】利用产排胶机理课题组构建的胶乳EST数据库，通过PCR技术克隆橡胶树GST基因的cDNA和基因组DNA；在线预测蛋白质保守功能域和亚细胞定位，构建系统进化树，利用实时荧光定量PCR分析割胶、伤害、低温、激素和死皮病等因素对该基因表达的影响。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到1个GST基因的全长cDNA（793 bp），编码25.4 kD（219aa）蛋白，命名为HbGSTU1；克隆了HbGSTU1的基因组DNA（1 313 bp），包含1个内含子（520 bp）和2个外显子。HbGSTU1属于GST Tau家族，推测是一种无信号肽的细胞质蛋白，其N端结构域包含结合GSH的G位点，C端结构域包含特异结合底物的H位点；HbGSTU1与一个蓖麻GST蛋白的亲缘关系最近，氨基酸序列的一致性为85%；HbGSTU1的表达受割胶、伤害、低温、2,4-D、乙烯利和死皮病等因素调控，但对JA、SA和ABA处理的应答不明显。【结论】HbGSTU1是一个典型的GST Tau家族蛋白，可能在橡胶树抗逆过程中起作用，可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因。     

橡胶树乳管表达多酚氧化酶基因HbPPO1的克隆与分析

根据EST序列设计引物,应用RACE和RT-PCR技术从橡胶树的胶乳(乳管细胞的胞质成分)中分离到1条长2 102 bp的c DNA,该序列包含1个1 803 bp的开放读码框(ORF),81 bp的5’UTR和218 bp的3’UTR;ORF预测编码600个氨基酸,其理论分子量为67.88 k Da,等电点为8.56,质体定位;蛋白含有多酚氧化酶特有的Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV结构域;蛋白与木薯、蓖麻、麻疯树和胡杨中同源蛋白的相似性分别为85.2%、82.0%、79.8%和78.2%,将基因命名为Hb PPO1。结果表明,在所分析的胶乳、树皮和叶片组织中,基因在胶乳中的表达丰度最高,且其表达水平受乙烯利显著抑制。     

橡胶树树皮HbbHLH基因三端序列的克隆及表达分析

[目的]为今后深入了解茉莉酸诱导橡胶树乳管分化的分子机理奠定基础。[方法]根据bHLH转录因子基因保守区设计引物,以橡胶树树皮RNA反转录第一链cDNA为模板,获得橡胶树树皮组织bHLH基因的EST序列,以此序列设计巢式引物,应用3′RACE技术对其三端序列进行克隆,并利用半定量RT-PCR分析该基因在茉莉酸处理后4 h、8 h、1 d、2 d、3 d的表达情况。[结果]克隆共得到1 084 bp的HbbHLH基因3端序列,序列分析发现该基因属于MYC型HLH结构域。表达分析结果显示,茉莉酸处理后,bHLH基因在8 h内表达逐渐增强,1 d、2 d时表达稳定最高,3 d时表达水平开始减弱。[结论]茉莉酸对HbbHLH基因的表达具有调控作用。     

巴西橡胶树LIM结构域基因克隆与生物信息学分析

根据乙烯利刺激巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA文库的EST序列信息,利用RACE技术从胶乳中成功克隆了1个含有LIM结构域的未知功能新基因HbLIM的全长cDNA。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA由1016bp的碱基组成,拥有1个570bp的开放阅读框编码189个氨基酸残基;推测氨基酸序列富含Lys,Ser,Ala和Leu,含有2个LIM结构域和2个N-豆蔻酰化位置。序列相似性分析表明,HbLIM编码的氨基酸序列与蓖麻、杨毛、葡萄相应的LIM基因的相似性高达98%,95%和92%。这些研究结果为深入探讨LIM结构域蛋白在巴西橡胶树乳管发育及乳管代谢中的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树不同死皮程度植株的胶乳生理参数分析

【目的】分析巴西橡胶树不同死皮程度植株胶乳的各生理参数,为橡胶树死皮的早期预测及死皮发生机理研究提供理论依据。【方法】测定热研7-33-97橡胶树不同死皮程度植株胶乳产量、胶乳硫醇、无机磷、蔗糖、粗酶液蛋白、镁离子含量及黄色体破裂指数等生理参数,分析其与橡胶树死皮发生的相关性。【结果】随着死皮程度的增加,橡胶树胶乳产量显著降低(P0.05,下同),胶乳的干胶、蔗糖、镁离子含量及黄色体破裂指数增加;其中死皮程度最严重的胶乳产量最低,为13.56 mL/株,胶乳的镁离子含量和黄色体破裂指数分别达41.57 mmol/L和55.22%。胶乳硫醇、无机磷含量及pH随死皮程度的增加而降低,其中胶乳硫醇和无机磷含量均显著低于健康树;粗酶液蛋白含量无显著变化(P0.05)。【结论】橡胶树胶乳硫醇、无机磷、镁离子含量及黄色体破裂指数等生理指标与其死皮程度密切相关,可作为橡胶树死皮早期预测的关键指标。     

橡胶死皮相关液泡型水通道蛋白基因TIP1的克隆与序列分析

[目的]死皮是指橡胶树（Hevea brasiliensis）产排胶过程中出现的一种割线症状,它会造成橡胶减产甚至完全绝收.研究对一死皮相关的水通道蛋白（Aquaporin,AQP）基因进行克隆和序列分析,以探讨AQP在死皮发生过程中的作用.[方法]基于一条在死皮植株中下调表达的EST,研究采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法从橡胶树的树皮中扩增出HbTIP1 774 bp的cDNA,在此基础上采用生物信息学对基因的序列特征、编码蛋白的理化特性及进化关系进行了分析.[结果]该cDNA包含759 bp的ORF、8 bp的5＇UTR和7bp的3＇ UTR;基因预测编码252个氨基酸,理论分子量为25.88 kD,等电点为4.96.生物信息学分析显示,HbTIP1含有1个保守的MIP结构域,6个跨膜螺旋,液泡膜定位,可归为水通道蛋白（Aquaporin,AQP）家族TIP亚族.同源分析显示,Hb TIP1与可可（Theobroma cacao）、人参（Prunus persica）、橙子（Citrus sinensis）和蓖麻（Ricinus communis）中同源蛋白的相似性都在90％以上,显示出高度的保守性.[结论]该研究为下一步揭示AQP调控死皮发生机制创造了条件.     

巴西橡胶树线粒体50S核糖体蛋白L21 cDNA的克隆与分析(英文)

[目的]在橡胶生产中,一种叫做"死皮"的生理综合症严重制约了橡胶树(Hevea brasiliensis)单产的提高。为揭示橡胶树"死皮"发生的分子机理,研究对一差异表达的HbmRPL21进行了克隆,并在此基础上对其进行深入的生物信息学分析。[方法]在早期构建的差减文库中,筛选到一条在死皮植株中下调表达的基因片段,该片段编码的蛋白与线粒体50S核糖体蛋白L21(mRPL21)同源。通过ESTs序列拼接和RT-PCR,获得一条853bp的cDNA序列(命名为HbmRPL21,GenBank登录号为HM800425),该序列包含一个完整的开放读码框。[结果]信息分析表明,HbmRPL21编码271个氨基酸,理论分子量为30.52kD,等电点为8.40,HbmRPL21是一个包含Ribosomal_L21p保守结构域的线粒体定位蛋白。进化分析表明,植物和动物界间mRPL21序列差异很大,而植物界内则相对比较保守。[结论]研究为下一步阐明HbmRPL21在橡胶树"死皮"中的生物学功能奠定了理论基础。     

巴西橡胶树HbEPSPS基因逆境响应功能解析

草甘膦除草剂的靶标酶为5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。为研究HbEPSPS基因在橡胶树中的逆境响应功能,分析其在草甘膦、机械伤害、白粉菌侵染和不同激素处理下的表达模式。结果表明:草甘膦、机械伤害和IAA处理诱导HbEPSPS显著上调;干旱、ABA、SA和ETH处理亦能诱导HbEPSPS显著上调;H2O2处理橡胶树叶片中HbEPSPS表达呈现双峰规律;白粉菌侵染叶片,HbEPSPS表达显著下调。不同部位表达分析结果表明,HbEPSPS基因在花中表达量最高,其次是树皮和叶,在胶乳中表达量最低。此结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树草甘膦药害和激素信号响应中具有重要作用,为研究其在橡胶树抗逆机制中的作用奠定良好基础。     

茶树油处理割线对天然橡胶产量及胶乳生理的影响

比较了不同体积分数茶树油处理橡胶树Hevea brasiliensis割线对橡胶产量和产排胶生理特性的影响,并与体积分数为0.5％乙烯利处理作了比较结果表明:与对照比较,用体积分数为80％和100％茶树油涂抹割线可增加胶乳产量并使橡胶树的产排胶生理特性发生较大变化,其中镁离子和无机磷极显著增加(P＜0.01),硫醇降低体积分数为100％茶树油与体积分数为0.5％乙烯利处理的增产效果相当,但前者的干胶和蔗糖极显著高于后者(P＜0.01),而硫醇则显著低于后者 茶树油刺激增产的机制可能有别于乙烯利刺激增产理论.     

巴西橡胶树MADS-27基因的克隆与生物信息学分析

以巴西橡胶树花芽为材料,利用RT—PCR技术从总RNA中扩增获得1个MADS基因。eDNA长度1063bp．开放阅读框717bp,编码239个氨基酸．命名为HbMADS-27。在HbMADS-27氨基酸序列中具有1个较强的跨膜区,二级结构分析结果表明其属于混合型蛋白。HbMADS-27在N端前34-50氨基酸区域内为较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对20个MADS蛋白进行系统进化分析,结果发现,巴西橡胶树的HbMADS-27基因与蓖麻的MADS-27基因亲缘关系最近,而与拟南芥MADS-27基因亲缘关系相对较远。     

橡胶延伸因子REF基因的克隆、转化及功能分析

取巴西橡胶树新鲜橡胶胶乳,利用改良CTAB法提取胶乳总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank中REF基因序列的报道,设计特异性引物,Taq酶扩增,获得REF基因并构建DHN pBin 438-REF植物表达载体。利用叶盘转化法侵染橡胶草无菌幼嫩叶片,通过RT-PCR方法鉴定阳性植株,对其可溶性糖、胶乳和蛋白质含量等进行检测。结果表明,转基因橡胶草可溶性糖质量浓度为0.053 8g/L,约是野生型橡胶草的2倍;橡胶是野生型植株橡胶的1~3倍;而转基因橡胶草中REF基因在蛋白质水平高效表达,其中根和花梗中REF基因高效表达。本研究通过农杆菌介导的遗传转化,获得5株阳性转基因橡胶草植株,分子生物学结果表明,REF基因可在橡胶草中稳定表达,并显著地提高橡胶草中合成天然橡胶的生物量。     

黄灯笼椒辣椒素合成途径pal基因克隆及表达分析（英文）

该研究对黄灯笼椒pal基因进行了PCR扩增、测序及生物信息学分析,在此基础上构建原核表达载体（pET-32a-pal）进行原核表达,分析外施茉莉酸条件下基因表达模式和辣椒素积累情况。生物信息学分析表明黄灯笼椒pal基因编码的蛋白质由683个氨基酸残基组成,蛋白质的分子量为74.28 kD,等电点为6.97。将原核表达载体在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明,诱导后表达目的蛋白质相对标准分子质量约为74 kD,与DNAMAN软件预测的（74.2 kD）基本一致。蛋白质序列比对和进化树分析表明,黄灯笼椒Capal蛋白与朝天椒Capal蛋白一致性较高,进化距离最近。Real-time PCR分析表明,外源茉莉酸处理对pal基因表达有上调作用;高效液相色谱（HPLC）分析茉莉酸处理后辣椒素含量发现,外源茉莉酸可以促进辣椒素的合成。该研究将为pal基因转录调控和功能研究提供参考。