鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌基因组消减文库的构建

为了解鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的基因组差别,筛选鸡白痢沙门氏菌特有的序列,利用SSH对鸡白痢沙门氏菌C79-13(实验方)与鸡伤寒沙门氏菌Sg9(驱动方)基因组进行了比较。选择四碱基内切酶Rsa I将C79-13与Sg9基因组DNA酶切,酶切的C79-13基因组DNA分成两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR,得到消减混合物,将其与PCR 2.1克隆载体连接,转化感受态E.coli DH5α建立消减文库。结果共获得400个阳性克隆;筛选240个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2000 bp大小的片段。差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆鸡白痢沙门氏菌特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。     

沙门氏菌入侵因子基因保守序列的克隆与分析

分别提取鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌染色体DNA,用设计的专一性引物扩增沙门氏菌入侵因子基因保守序列，PCR产物经凝胶回收纯化，克隆于TE栽体，在含X—gal、IPTG的AmpLB平板筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，对目的片段进行测序。结果表明，扩增出的序列与GenBank中发表的基因序列一致。通过Blast比对，发现从3种沙门氏菌菌株克隆出的片段所编码的氨基酸序列中，鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌相嗣，鸡白痢沙门氏菌与前两种相差1个氨基酸。     

鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌的PCR-RFLP分子鉴别

根据鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌fliC基因可变区两端的保守序列设计1对引物，PCR扩增出约600bp的产物，用Hin6I对PCR产物进行酶切，经RFLP分析区分鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌的生物型。利用该技术对6株鸡白痢沙门氏菌标准株及2株鸡伤寒沙门氏菌标准株进行分子鉴别，得到的结果与预计的RFLP模式相符，证明该方法可行。在此基础上对我国不同地区、不同年代的191株鸡沙门氏菌进行分子鉴别，191株中有185株分离株符合鸡白痢沙门氏菌的RFLP模式，6株分离株符合鸡伤寒沙门氏菌的RFLP模式，其中有176株PCR—RFLP鉴定结果与生化特性符合率达100％，另有15株根据生化特性不能鉴别。     

青稞抗黄矮病抑制差减文库的构建及差异表达基因的分离

本研究应用抑制差减杂交方法构建了感染黄矮病毒早期,高抗病和高感病青稞种质的差减cDNA文库,共获得了143个带有插入片断的克隆。以构建的抗黄矮病抑制羞减文库的62个片段为基础,对抗病青稞品种52号和感病青稞品种品引5号在感染黄矮病后24h的差异表达基因进行了杂交筛选,获得了9个差异表达的基因片段。对这些片段进行序列分析和同源对比,获得了5个抗性相关基因片段。片段U3,U24在感染后24h的抗性品系中表达增强,同时在EST序列比对中没有发现同源序列,可能为新的抗性相关基因。片段U58,U62为分别在抗性和感性品种中高表达的叶绿体相关基因。片段U23为多胺代谢通路相关基因。通过对这些基因片段的分析,对青稞感染黄矮病早期抗性的机制进行了初步的探索。     

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定

为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。     

鸡白痢沙门氏菌感染对雏鸡脾脏miRNA表达谱的影响

【目的】鉴定感染鸡白痢沙门氏菌后雏鸡脾脏差异表达的miRNA，为阐明miRNA在鸡白痢沙门氏菌感染中的调控机制提供理论基础。【方法】采集感染和未感染鸡白痢沙门氏菌的SPF雏鸡脾脏，提取脾脏RNA，构建6个miRNA文库；利用Illumina Hiseq 2500测序技术和生物信息学分析筛选差异表达miRNA，通过TargetScan和miRanda算法预测差异表达miRNA的靶基因，并进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，最后利用RT-qPCR方法验证测序结果。【结果】鉴定到29个差异表达miRNAs，其中15个显著上调、14个显著下调。GO分析表明：脂多糖介导的信号通路正调控以及NIK/NF-κB介导的信号通路负调控等免疫相关生物学过程显著富集；KEGG分析显示：差异表达的miRNA主要参与溶酶体和内吞作用等免疫相关通路。高通量测序结果与RT-qPCR结果一致。【结论】成功鉴定到鸡白痢沙门氏菌感染雏鸡脾脏miRNA表达谱，获得29个鸡白痢沙门氏菌感染潜在相关miRNAs。     

金鱼头瘤形成相关基因差减文库的构建与分析

采用差减抑制杂交技术(SSH)以1龄红狮头金鱼(Carassius auratus)的头瘤组织为检测子(Tester),40日龄红狮头金鱼幼鱼的头顶上皮组织为驱动子(Driver),构建金鱼头瘤相关基因的差减cDNA文库。以鲫管家基因α-tubilin为参照检测差减效率,结果表明该文库差减效率达210倍,效率较高。随机挑选阳性克隆进行接头特异引物的PCR检测,结果表明插入片段均在0.1~2.0kb之间。利用斑点杂交对PCR检测结果为单一条带的阳性克隆进行筛选并测序,获得高差异性的有效序列93条。通过生物信息学方法对文库序列进行比对、分类和注释,发现若干结缔形成基因和原癌/抑癌基因等与金鱼头瘤形成相关的功能基因,表明cDNA文库构建成功。     

减毒鸡白痢沙门菌△aroA株的构建与致病性分析

以鸡白痢沙门氏菌c79-3强毒株为亲本,通过λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌aroA基因缺失株△aroA,并进行了测序验证和毒力试验。结果表明,aroA基因缺失株的生长速度较亲本株缓慢,且该缺失株具有良好的遗传稳定性;相比野生菌株,aroA基因缺失株的毒力发生了下降,雏鸡攻毒死亡率较亲本株低。本研究获得的减毒鸡白痢沙门氏菌aroA基因缺失株△aroA,为进一步研究鸡白痢沙门氏菌aroA基因的功能和后续减毒活疫苗开发奠定了基础。     

牛源性肠炎沙门氏菌的三型分泌系统基因分析

肠炎沙门氏菌是一类引起人与动物腹泻的病原菌,其致病性与三型分泌系统密切有关.本次试验研究临床上腹泻牛体内分离的一株肠炎沙门氏菌致病性与三型分泌系统的关系,试验选取SipA、SipD的基因序列进行测序分析.本次试验分别运用特异性引物扩增SipA、SipD的基因,连接到T载体上并测定目的片段序列.测出的序列在GeneBank上进行比对,以确定分离菌与其他菌株亲缘关系.试验结果显示该株肠炎沙门氏菌的SipA基因、SipD基因与肠炎沙门氏菌P125109同源性达100％.     

应用抑制性差减杂交技术分离椪柑枯水相关基因

【目的】探索椪柑枯水分子机理,寻找柑橘枯水应答基因,为柑橘枯水防治奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术以椪柑正常果肉cDNA作为Driver,以枯水果肉cDNA作为Tester构建正向差减文库。【结果】挑选了300个有效克隆进行测序分析,260个测序成功。经BLASTx比对分析,197条表达序列标签（ESTs）找到了分属于52个基因的同源序列;63条ESTs同源性较低或没有同源性。对文库中编码β-微管蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、转运蛋白、天冬氨酸蛋白酶前体、WRKY转录因子21的基因进行实时定量RT-PCR验证,结果显示这8个基因均明显上调表达。这些差异性表达基因主要涉及衰老、抗逆防御、几丁质和细胞壁代谢、蛋白降解等过程。【结论】通过构建椪柑果肉枯水正向文库,得到一些与枯水相关的基因,这些基因反映了果实对枯水的调控情况,可作为今后防治枯水病害的候选基因。     

食品中沙门氏菌检测方法的探讨

介绍了沙门氏菌污染的危害,并探讨了几种主要的检测方法。这些快速检测方法对于沙门氏菌的检测具有良好的应用前景。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡肠炎沙门氏菌感染的增强作用

本试验对柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)感染对肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)感染的影响进行了研究。实验结果表明:肠炎沙门氏菌和柔嫩艾美耳球虫的相互作用显著;在球虫感染后第4,10,14d 时,柔嫩艾美耳虫球虫感染可显著地(P<0.01)增加盲肠内容物中肠炎沙门氏菌数量。肠炎沙门氏菌和柔嫩艾美耳球虫之间协同作用与肠炎沙门氏菌的感染量大小和感染后的时间显著相关(P<0.01)。柔嫩艾美耳球虫感染并没有显著地提高肝脏、脾脏中肠炎沙门氏菌的阳性率。不同感染量的肠炎沙门氏菌感染对鸡盲肠的球虫病变记分显著影响.     

山西省鸡沙门氏菌病流行病学调查分析

对山西省境内相关媒介材料中鸡沙门氏菌进行了分离、培养及抗原血清型鉴定,对7个父母代蛋种鸡场和5个规模化商品蛋鸡场沙门氏菌病血清抗体进行了调查。结果显示:(1)分离的961份媒介材料中,177份存在鸡沙门氏菌,阳性率为18.4%,以鸡白痢沙门氏菌和伤寒沙门氏菌为主,血清型为O9和O12。(2)媒介材料中引进的3日龄左右父母代种雏,泄殖腔拭子分离阳性率为20%,成为沙门氏菌病传入山西省的主要原因;病鸡的分离率为81%,种蛋的阳性率为15%,成年鸡肛拭分离率为5.7%,饲料中的分离率为5%,环境中的分离率为1.9%,这些是造成沙门氏菌病在山西省水平传播的主要因素。(3)37 554羽份父母代种鸡,沙门氏菌病血清抗体阳性率平均为2.6%,最高为47.8%;2 441羽份商品蛋鸡阳性率平均为15%。     

骨粉中利卡沙门氏菌的检测及分析

本文参照GB/T13091-2002和GB4789.4-2010方法对1份骨粉样品进行沙门氏菌检测.结果表明:25 g样品中检出沙门氏菌,经血清分型确认为利卡沙门氏菌,该沙门氏菌血清型在四川省属首次检出.同时对样品受污染原因进行了研究,旨在为避免骨粉类产品受沙门氏菌污染提供意见与参考.     

具毒性质粒沙门氏菌的快速检测

针对沙门氏菌毒性质粒spvR基因设计PCR引物,检测具有毒性质粒的沙门氏菌.6株常见具有毒性质粒的沙门氏菌均获得特异性扩增,11株常见的无毒性质粒的沙门氏菌均未获得特异性扩增,5株非沙门氏菌检测结果均为阴性.结果表明,所设计引物具有高度特异性,适用于具毒性质粒沙门氏菌的快速检测.     

鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及耐药性分析

采集菏泽地区发病鸡场疑似鸡白痢病鸡的泄殖腔棉拭子,进行细菌分离,并对分离细菌进行生化鉴定、血清型鉴定和药敏试验.结果显示,分离得到32株鸡白痢沙门氏菌,其中16株O9、10株O1、6株O12,分别占50％、31.25％、18.75％;分离株对头孢噻肟、丁胺卡那霉素、多黏菌素B表现出高敏感性,敏感菌株的比率分别为93.8％、90.6％、84.4％,对四环素、磺胺嘧啶、诺氟沙星表现出高的耐受性,耐受菌株的比率分别为100％、78.1％、71.9％.可见,头孢噻肟、丁胺卡那霉素、多黏菌素B可作为菏泽地区养鸡场防治鸡白痢沙门氏菌病的首选药物,其他药物须减少或暂停使用.     

福州市生食蔬菜沙门氏菌污染状况分析

为了解福州市销售的生食蔬菜中沙门氏菌的污染状况,初步确定污染沙门氏菌的高危生食蔬菜种类,本研究按照GB/T 4789.1-2008规定的方法采集福州市4家综合型超市的生食蔬菜样品48份,使用选择性培养基分离沙门氏菌,采用PCR技术对疑似沙门氏菌菌落进行鉴定。结果发现4大类生食蔬菜中,生菜被沙门氏菌污染的状况最为严重,阳性检出率16.7%,而其余3大类生食蔬菜中均未检出沙门氏菌污染。从结果可得出,福州市销售的生菜已在一定程度上受到沙门氏菌污染。     

食品中沙门氏菌能力验证样品的鉴定与分析

[目的]掌握食品中沙门氏菌能力验证中可疑菌落的分离及鉴定,分析食品中沙门氏菌检验过程中存在漏检的可能性及判定方法。[方法]按照沙门氏菌能力验证作业指导书及GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》的要求对编号为224号、740号、845号3份能力验证考核样品进行沙门氏菌的检测。[结果]3份样品中均检出沙门氏菌,其中224号样品中检出沙门氏菌双相亚利桑那亚种。[结论]3份能力验证样品结果均为满意。