嗜水气单胞菌和温和气单胞菌快速PCR方法检测

本研究根据GenBank数据库已发表的气单胞菌属16S rDNA序列,设计嗜水气单胞菌、温和气单胞菌16S rDNA序列的特异保守区,建立这2种菌的快速PCR检测方法。结果表明,仅嗜水气单胞菌和温和气单胞菌得到了特异性扩增,而几种常见弧菌科水产病原菌,包括豚鼠气单胞菌、易损气单胞菌、杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和鳗弧菌并未得到特异性扩增,说明设计的引物可以用于这2种病原的PCR快速检测方法的建立,可以为水产动物嗜水气单胞菌、温和气单胞菌的快速检测、病害预警和病原调查提供技术支撑。     

舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。     

斑点叉尾鮰败血症3种病原多重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症3种病原(嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌)的多重PCR检测方法。【方法】根据嗜水气单胞菌溶血素基因(Hly)、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因(DNaseⅠ)以及鮰爱德华菌溶血活化基因(Eha)的保守序列,设计3对特异性引物,优化并建立斑点叉尾鮰败血症3种主要病原菌的多重PCR方法,对其特异性和灵敏度进行考察,并将其用于临床样品的检测。【结果】建立的多重PCR方法,当Hly基因、DNaseⅠ基因以及Eha基因的引物浓度分别为1.0,1.0和0.5μmol/L,退火温度为59.5℃时,各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明,建立的多重PCR方法可从嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌分别扩增出1 091,262和450bp的目的片段,从多种细菌DNA的混合种也可扩增出上述目的片段,而对其他对照组的扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,建立的多重PCR最低可分别检测出200CFU/mL的嗜水气单胞菌、300CFU/mL的维氏气单胞菌和200CFU/mL的鮰爱德华菌;对临床样本的检出率为100%,与传统生物学检测结果的符合率为100%。【结论】建立的多重PCR检测方法特异、灵敏、快速,可单独或同时检测斑点叉尾鮰败血症嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌3种主要病原菌,也可以用于其他水生动物上嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌的检测。     

鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立

根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义.     

蟹源易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其PCR检测

利用设计的特异引物,采用PCR技术,对蟹源致病性易损气单胞菌气溶素基因(aer)进了克隆和序列分析,从其基因组中克隆出长为622 bp的基因片断,用限制性内切酶BamHI对扩增产物进行酶切,产生长约570 bp和50 bp两条片断;研究还利用设计的特异引物,对蟹源致病性易损气单胞菌进行PCR快速分子鉴定的研究.     

大鲵致病性嗜水气单胞菌PCR诊断方法的建立

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌气溶素基因（hlyA）序列,设计1对特异性引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的PCR诊断方法。结果表明,扩增的阳性条带约为600 bp,特异性、敏感性结果显示,该PCR方法对致病性嗜水气单胞菌DNA的最低检测量为0.4 ng/L,而非致病性嗜水气单胞菌、大肠杆菌、黄杆菌、弗氏柠檬酸杆菌的扩增结果均为阴性。对123份大鲵病料进行检测,结果建立的PCR方法检测结果与细菌学和生化检验结果符合率为97.6%,表明该PCR方法能够对大鲵致病性嗜水气单胞菌样品进行快捷、灵敏、准确的检测。     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

[目的]建立一种基于PCR的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。[方法]采用平板划线法从患病鲫鱼病灶部位分离、纯化获得嗜水气单胞菌,采用CTAB法提取DNA,根据GenBank已经登录的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因保守序列设计引物P1和P2,并以P1、P2为引物对其进行PCR扩增,将测序结果在Blast上进行比对分析。[结果]PCR扩增得到一条约540 bp的条带,Blast分析表明该基因与GenBank登录的气溶素基因的同源性达95.67%。[结论]试验建立的致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法简单、可行。     

温和气单胞菌TL97528株丝氨酸蛋白酶基因片段克隆与序列分析

中华鳖(Trionyx sinensis)细菌性疾病主要由气单胞菌感染引起的,通过脱脂奶平板检测及酶活性试验得出温和气单胞菌TL97528株分泌的胞外蛋白酶为丝氨酸蛋白酶,而丝氨酸蛋白酶是气单胞菌的主要毒力因子。根据已发表的嗜水气单胞菌的丝氨酸蛋白酶基因序列保守区域设计引物,PCR扩增出一长度为809 bp大小的特异片段,该序列在Genbank上的登录号为FJ357446。对该序列进行分析发现,已发表的温和气单胞菌(Aeromonas sobria)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为AF253471)同源性为98%、与其他几株已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号分别为AF126213、AY841795、DQ127822、CP000462、CP000644、AF159142)同源性分别为98%、82%、82%、82%、81%、81%,与杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)丝氨酸蛋白酶基因(GenBank登录号为X67043)同源性为80%。用DNAstar软件分析,与鳖源温和气单胞菌TK961010株的同源性为98%,...     

维氏气单胞菌flrB基因敲除株构建及其生物特性鉴定

维氏气单胞菌是一种常见的人鱼共患致病菌,为研究维氏气单胞菌中的flrB基因的功能,笔者通过扩增flrB基因上下游同源臂连接至pRE112质粒中,电击转化重组质粒至大肠杆菌WM3064,接合转入野生型维氏气单胞菌,在蔗糖压力下筛选、PCR和测序验证敲除菌株。结果表明,敲除flrB基因后降低生物膜的形成,但不影响维氏气单胞菌的生长。flrB基因能促进其生物膜的形成,这为进一步揭示该基因的功能和作用机制奠定了基础。     

食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因的多重PCR检测技术研究

本研究目的是建立检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌气溶素基因(aerA)和溶血素基因(ahh1)的技术。气溶素和溶血素是β-溶血性嗜水气单胞菌重要的毒力因子。多重PCR技术被应用于检测28个来源于食用鱼类产品的β-溶血性嗜水气单胞菌样本,包括鲤鱼片,水,鲫鱼片、鳟鱼片、鲢鱼片、鲑鱼片和带鱼片。该研究使用标准菌株嗜水气单胞菌ATCC7965和分离于死蟒蛇的带有β-溶血性毒素基因的嗜水气单胞菌作为对照。所有菌株样本(100%)被证实携带嗜水气单胞菌16srRNA基因(356个碱基对)。所有嗜水气单胞菌样本(100%)被证实携带ahh1毒性基因 (130个碱基对)。26个嗜水气单胞菌样本(93%)被证实携带aerA基因(309个碱基对)。本研究证实β-溶血性嗜水气单胞菌菌株广泛存在于供人类食用的鱼类产品中,对消费者产生了一定的健康风险。     

鲤鱼嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]分离、鉴定鲤鱼嗜水气单胞菌。[方法]从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子和16S rRNA基因序列的测定,研究分离菌的形态、生理生化特征及致病性。[结果]分离到的2株优势菌的菌落形态特征基本一致,经鉴定,确认为嗜水气单胞菌。无菌滤液试验表明,鲤鱼细菌性败血症不是由病毒引起的。腹腔注射分离菌菌悬液的鱼在7 d内全部死亡,人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又可分离到该菌株。分离提纯的致病菌株产生了β-溶血环,经蛋白酶试验为阳性。16S rRNA基因序列同源性分析发现同源性为98%。[结论]嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的致病菌。     

三北地区鱼源气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

选取三北地区鲤、鲫、草鱼、大西洋鲑等鱼体内分离到的气单胞菌共16株,结合革兰氏染色、氧化酶反应和分子生物学方法对其进行鉴定后,采用K-B药敏纸片法测定16株菌对10类25种药物的敏感性。结果表明:16株菌均为革兰氏阴性、氧化酶阳性细菌;Blast比对分析发现实验菌株的16S rRNA序列分别与Gen Bank数据库中维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌的不同菌株的16S rRNA基因序列同源性较高,相似性达95%以上;系统发育树显示16株菌分别与维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌的不同菌株聚为一支,而与肠杆菌、志贺菌和弧菌分支较远,从而判定为维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌;16株分离菌中有3株维氏气单胞菌、4株嗜水气单胞菌、3株温和气单胞菌和6株杀鲑气单胞菌;药敏试验中16株气单胞菌对氨苄西林、青霉素G、阿莫西林、三甲氧苄氨啶、复方新诺明、磺胺异噁唑、氯霉素、利福平具有较高的耐药性,耐药率达95%以上,对氟喹诺酮类药物普遍较敏感,不同菌株之间的耐药谱存在很大差异。为气单胞菌的鉴定及三北地区淡水鱼细菌病的药物防治提供科学依据。     

羊源杀鲑气单胞菌16S rRNA基因的克隆测序及分析

从重庆市丰都县无菌采集山羊血液,提取全血基因组,用16SrRNA基因的引物进行PCR扩增,得到2条长约1 500bp的扩增片段,将其克隆到pMD19-T载体后进行测序,并与3条豚鼠气单胞菌,3条嗜水气单胞菌,3条中间气单胞菌,4条杀鲑气单胞菌,2条温和气单胞菌,3条维氏气单胞菌和5条舒氏气单胞菌16SrRNA基因序列进行系统发育分析.结果表明:所克隆的基因片段长度均为1 507bp,GenBank登录号为JF823571和JF823572.系统发育分析发现2条序列均被聚类到杀鲑气单胞菌群,并与温和气单胞菌聚类到一个大的分支.同源性比对结果显示所获得的序列与杀鲑气单胞菌法国株(ATCC33658T)X74681和阿根廷株AF134065的同源性最高,均为99.6%,表明重庆地区存在受杀鲑气单胞菌感染的山羊.     

石龟嗜水气单孢菌的分离鉴定及药敏特性研究

从患病石龟上分离获得1株革兰氏阴性杆菌，菌体细长、无芽孢和荚膜，在山羊血琼脂平板上能形成明显的β-溶血圈。经小白鼠致病性试验、生理生化鉴定及16SrRNA序列分析，确定该分离株为致病性嗜水气单孢菌。经同源性及遗传进化分析发现，该菌株与嗜水气单孢菌B27、HSO2（Genbank登录号：FJ494900．1、FJ562211．1）同源性高达99．5％。而药敏试验表明，该分离株除了对赛福欣（复方恩诺沙星）、肠清（复方乳酸环丙沙星）2种药物高度敏感外，对大部分抗菌素均不敏感。     

嗜水气单胞菌的分离与16S rDNA鉴定

[目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌,并构建系统发育分析.[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养,并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析.[结果]分离培养到1株细菌,命名为Ah1305.经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析,鉴定为嗜水气单胞菌.[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考.     

嗜水气单胞菌气溶素和溶血素基因的克隆与结构预测

从患出血病草鱼体上分离出1个菌株,传统分类学及16SrRNA基因鉴定其为嗜水气单胞菌,人工感染实验显示该分离菌株为强毒株。克隆该菌株的气溶素(aerolysin,aerA)基因和溶血素(hemolysin,hlyA)基因,序列分析显示这2个基因只有46.7%的同源性。Blast分析显示,hlyA基因与GenBank上已登录的hlyA序列具有较高的同源性,而aerA基因与已登录的aerA基因以及一些hlyA序列也具有较高的同源性。对与aerA基因同源性较高的这些hlyA序列进行结构域预测,发现它们均具有APT结构域和气溶素结构域,说明它们实际上应是aerA基因,只是命名上与hlyA基因混淆。用DNAstar软件预测aerA和hlyA的抗原区,显示它们均具有很好的抗原性。用特异性引物检测菌株的aerA基因和hlyA基因,结果显示2株毒力株均有特异条带,而无毒株则未扩增到特异条带,说明aerA和hlyA有可能作为鉴定嗜水气单胞菌毒力菌株的标记。     

体外药动模型中恩诺沙星对嗜水气单胞菌的药动及药效研究

为降低嗜水气单胞菌耐药菌株的产生速度,延长恩诺沙星在水产动物上的应用年限,通过建立体外模型的方法,研究恩诺沙星对嗜水气单胞菌的药动-药效(PK-PD)参数。在消除半衰期为100h的模型内,2MIC(最小抑菌浓度)的恩诺沙星对嗜水气单胞菌能够抑制6h,6h后细菌出现再生长;4、8和16MIC对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。在消除半衰期为168h的模型内,2MIC的恩诺沙星对嗜水气单胞菌能够抑制6h,6h后细菌出现再生长;4、8和16MIC对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。结果表明,当AUC0→24/MIC>75.24±13.24,Cmax/MIC>4.10±0.12时,恩诺沙星对嗜水气单胞菌能够起到持续的抑制作用。     

斑点叉尾鮰套肠症病原分离与鉴定

为鉴定四川省乐山市某池塘养殖患病斑点叉尾鮰的病原菌,从其肝脏组织分离纯化得到一株优势菌,采用形态学观察、生理生化特性鉴定以及16S rRNA、gyrB基因序列检测对该菌株进行了鉴定,并通过人工感染实验和药敏实验对菌株的致病性和药物敏感性进行了分析。结果显示,分离菌株为革兰氏阴性短杆菌,其生理生化特征与气单胞菌相似,结合16S rRNA和gyrB基因序列分析,最终确定该菌株为嗜水气单胞菌。人工感染实验显示,该菌株对斑点叉尾鮰具有较强的致病性,症状主要表现为急性充出血和套肠症,与斑点叉尾鮰发病症状一致,证明该病原为引起斑点叉尾鮰发病的主要病原。药敏实验显示,菌株仅对氧氟沙星和氟苯尼考敏感,而对其他药物低敏感或不敏感。本研究鉴定了可引起斑点叉尾鮰套肠症的病原,并对其当前的致病性和药物敏感性进行了分析,为斑点叉尾鮰该病的防治提供了理论参考。