草鱼转铁蛋白受体cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼血清转铁蛋白受体(TfR)序列(NM_001009918)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼TfR cDNA部分序列873bp,获得GenBank登陆号为FJ613322.将测序结果用DNAman软件与斑马鱼的序列进行比对,发现核苷酸同源性为84%,氨基酸同源性为81%.利用半定量RT-PCR技术检测TfR草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、黏液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12种组织的表达差异结果表明,TfR在草鱼12种组织中均可表达,其中在脑与鳍中表达量最高,但与在心脏、性腺中的表达量无显著差异(P0.05),在黏液与鳔中表达量最低,二者之间无显著差异(P0.05).     

长丝裂腹鱼MyoD1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆长丝裂腹鱼的MyoD1基因,并对其进行序列分析。[方法]根据鲤鱼(Cyprinus carpio)的MyoD1基因序列设计引物,采用RT-PCR方法对长丝裂腹鱼MyoD1的全长cDNA序列进行扩增,并对该基因编码氨基酸的理化性质及同源性进行预测和分析。[结果]试验获得了包括完整ORF的长丝裂腹鱼MyoD1基因,该序列长957 bp,编码274个氨基酸,具有MRFs家族基因的典型性碱性bHLH结构;该MyoD1序列与齐口裂腹鱼、鲤鱼、斑马鱼和虹鳟等的MyoD1序列同源性较高,与人、猪、牛等哺乳动物的同源性较低。[结论]该研究为长丝裂腹鱼的肌肉发育和肉质特性形成的分子机制研究提供了基础数据,同时为青藏高原冷水鱼资源的利用与保护提供了指导意义。     

草鱼抗病毒基因Mx全长cDNA的克隆、序列分析与真核表达载体构建

Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域和一个发动蛋白家族的典型结构特征序列。生物信息学分析表明,草鱼Mx基因所编码的蛋白质以亲水区域为主,具有丰富的B细胞抗原位点,但无明显的核定位序列,空间结构包括N端的GTP酶结构域(GTPase domain)、中间的中央相互作用结构域(central interactive domain,CID)和C端的GTP酶效应结构域(GTPase effector domain,GED)。同源性分析显示,草鱼Mx蛋白氨基酸序列和其他物种的相似性为45.1%～99.7%。此外还成功构建了含草鱼Mx基因cDNA全序列的真核表达载体pEGFP-C1-Mx。研究亮点:首次通过干扰素诱生剂PolyI∶C诱导草鱼肾细胞的方法克隆得到了草鱼抗病毒基因Mx cDNA全序列,并且借助生物信息学软件对其编码的氨基酸进行了序列分析,还成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-Mx,为进一步研究草鱼Mx蛋白的生物学活性及其在抗鱼类病毒性疾病中的应用奠定基础。     

草鱼E3泛素连接酶Nrdp1基因cDNA克隆和表达分析

神经调节素受体降解蛋白1(neuregulin receptor degradation protein-1,Nrdpl)是一种新的E3泛素连接酶,可调节细胞增殖和凋亡等。研究采用RACE方法从草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝脏中克隆了Nrdpl的全长cDNA序列;采用半定量RT-PCR方法分析该基因在草鱼不同组织中表达情况。结果表明:该序列全长cDNA大小为1 865 bp(GenBank登录号:JX864048),其中开放阅读框为954 bp,编码318个氨基酸,预测分子量大小为36.09 ku,pH为7.0时理论等电点为5.83;5’和3’非翻译区的长度分别为291 bp和620 bp,在3’非翻译区发现2个mRNA不稳定信号(ATTTA)和1个多聚腺苷酸加尾信号(ATTAAA)。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,其二级结构主要以α-螺旋为主,不含β-折叠。氨基酸序列保守性分析表明,草鱼Nrdp1与斑马鱼、虹鳟及人的同源性分别为98%、94%和89%;该基因在心脏和脑中的表达量较多,在肌肉和血液中表达很少。     

草鱼MyoD基因原核表达研究

采用PCR方法对草鱼MyoD基因开放阅读框进行了改造扩增,构建了草鱼MyoD基因的原核表达载体pBV 220-M yoD,并进行了初步的原核表达研究。结果表明,构建的原核表达载体pBV 220-M yoD含有草鱼My-oD基因完整的开放阅读框;该原核表达载体表达产物的相对分子质量为34 ku,其表达产物占全菌蛋白的10.8%,表达量较低。     

草鱼MHCⅡα基因cDNA的克隆与组织表达分析

采用快速扩增cDNA末端方法,获得1007bp草鱼MHCⅡα基因全长eDNA片段,序列包括717bp的开放阅读框、34bp的5’端非编码区以及256bp的3’端非编码区．氨基酸序列比对和同源性比较分析结果表明,草鱼MHCⅡα与鲤鱼MHCⅡα相似性最高,为79％,与斑马鱼的相似性为75％,与人的相似性最低,为34％．RT-PCR组织表达分析,MHCⅡα基因在正常草鱼组织中除了肌肉中没有扩增出MHCⅡα基因转录本外,在所检测的其他组织中都有不同程度的表达,其中脾脏、头肾有较强的表达,血液有中等程度的表达,肝脏、眼与肌肉相对表达较弱．     

草鱼hepcidin基因cDNA克隆、序列分析与表达

运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplication ofcDNA Ends,RACE)技术获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hepcidin基因全长cDNA,为774 bp,包括ORF 282 bp、5’UTR 117 bp和3’UTR 383 bp,3’UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和1个mRNA不稳定基序(ATTTA)。推定编码93个氨基酸,与其它鱼类hepcidin的序列同一性为27.9%～51.6%;SignalP 4.0软件预测信号肽位于1～24位。在邻接(neighbor-joining,NJ)法构建的系统进化树中,草鱼hepcidin前体肽和其他已报导的鱼类hepcidin前体肽聚为一枝。实时定量PCR(quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)检测结果显示hepcidin基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和眼等组织;柱状黄杆菌注射后4～48 h,hepcidin基因在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调。研究亮点:克隆到草鱼抗菌肽hepcidin一个新基因的全长cDNA,阐明了其所编码的hepcidin与其它脊椎动物hepcidin具有类似的结构与功能;证明其广泛分布于各组织中,参与了对细菌的免疫应答,是固有免疫的重要组成部分。     

暗纹东方鲀MyoD基因的克隆及生物信息学分析

提取暗纹东方鲀肌肉的总RNA,采用RT-PCR的方法来克隆暗纹东方鲀MyoD基因的cDNA序列,并通过生物信息学分析,对该基因所编码蛋白的理化性质、亲疏水性、亚细胞定位以及蛋白质结构等进行初步的分析和预测.结果显示,该基因编码区全长为846 bp,共编码了281个氨基酸,编码蛋白为亲水性非跨膜类蛋白,无信号肽结构,其亚细胞定位于细胞核中.系统进化树分析结果表明其与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近.     

香蕉果实expansin cDNA克隆及序列分析

提取成熟香蕉果肉的RNA并分离mRNA，以mRNA反转录合成cDNA，以该cDNA为模板，设计expansin的简并引物，进行RT-PCR(退火温度为50℃)，得到的扩增产物纯化后与pGEM-T-Easy载体连接，转化大肠杆菌，任意挑选2个阳性克隆，进行序列分析，结果得到2个序列相同的expansin的cDNA基因片段，命名为MA-Exp3(以示与已登录的香蕉MA-Expl和MA-Exp2的区别)，MA-Exp3中存在expansin基因的保守区域，即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基，它编码177个氨基酸，与MA-Exp1的核苷酸同源性为74．2％，氨基酸同源性为86．4％。     

粘虫核糖体蛋白S11基因cDNA的克隆和序列分析

【目的】克隆和鉴定粘虫核糖体蛋白S11(Ribosomal Protein S11,RPS11)基因,为昆虫核糖体蛋白功能的研究提供基础资料。【方法】运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫cDNA为模板,对RPS11基因进行克隆,获得其全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对RPS11基因全长cDNA序列及推测得到的RPS11蛋白氨基酸序列进行分析,构建其系统进化树。【结果】获得的粘虫核糖体蛋白S11基因(RPS11)cDNA序列长度为521 bp,其中包括26 bp的5′非编码区、36 bp的3′非编码区和459 bp的开放阅读框,编码一个由152个氨基酸组成的蛋白,其具有核糖蛋白S17蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫RPS11蛋白的理论分子质量为17.737 9 ku,等电点为10.63,富含6种类型的特定功能位点,与同属夜蛾科的烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的RPS11蛋白相似性高达97%。用Neigh-bor-joining(NJ)法构建基于RPS11氨基酸序列的系统发育树,结果显示,粘虫RPS11与烟芽夜蛾(H.virescens)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和家蚕(Bombyx mori)等3种鳞翅目昆虫的亲缘关系较近。【结论】成功获得了粘虫RPS11基因全长序列(GenBank登录号为GQ222274),由其编码的核糖体蛋白RPS11属于核糖蛋白S17蛋白家族。     

不同地理来源草鱼群体杂交后代的生长性能分析

[目的]该研究旨在评估10个不同地理来源草鱼群体(佛山群体、肇庆群体、荆州群体1、荆州群体2、荆州群体3、鄂州群体、益阳群体、长沙群体1、长沙群体2和江苏群体)杂交后代的生长性能.[方法]以该10个群体为亲本构建了15个杂交组合进行同塘生长对比.对4月龄、7月龄、8月龄、10月龄、12月龄、15月龄和18月龄的杂交组合后代的体质量进行测量.以4月龄体质量为协变量,运用协方差分析对不同杂交组合后代进行生长性能分析.[结果]在18月龄时荆州群体2♀×佛山群体♂杂交组合后代平均体质量最高,为1 892.90 g,比其他杂交组合平均体质量分别高3.51％～32.36％.经多重比较分析结果显示,荆州群体2 ♀×佛山群体♂和荆州群体1♀×佛山群体♂杂交组合后代的体质量显著高于其他杂交组合(P＜0.05).[结论]生产上,应用这2个具有生长优势的组合生产优质苗种进行推广,可大幅度提高渔民的经济效益,另外该结果可为快速生长草鱼核心群体的确定奠定基础.     

肠道菌群与草鱼个体大小相关性研究

[目的]探讨草鱼肠道菌群与草鱼个体大小之间的相关性。[方法]采用DGGE方法对同一批孵化并在同一池塘中养殖的个体大小显著差异的草鱼肠道样品进行分析。[结果]无论大个体草鱼还是小个体草鱼,其肠道优势菌群均为厚壁菌门和变形菌门,但2组草鱼在其肠道菌群的结构和多样性等方面存在差异。大个体草鱼肠道中存在着更多比例的厚壁菌门以及具有纤维素降解能力的细菌,而小个体草鱼肠道中存在较多的潜在致病菌。[结论]草鱼肠道微生物可以作为内在因素影响草鱼的生长性能,这一结果也为进一步开发可促进草鱼生长性能的益生菌奠定了研究基础。     

戊糖乳杆菌R1对草鱼幼鱼养殖水体和肠道菌群的影响

[目的]进一步评价戊糖乳杆菌R1作为益生菌的应用效果。[方法]在草鱼幼鱼中投喂添加由单一戊糖乳杆菌R1制备的微生态制剂和黄霉素,在60 d的投喂期内,采用平板计数法检测好氧性异养菌的总数、总弧菌数和戊糖乳杆菌R1的数量。[结果]结果表明,在投喂菌液和冻干菌粉后,养殖水体和草鱼肠道的戊糖乳杆菌R1数均呈上升趋势,在30 d后数量达到稳定并在肠道内定植;由于戊糖乳杆菌R1的抑制作用,弧菌的数量下降,以肠道中的弧菌最明显;乳酸菌对养殖水体和草鱼肠道的好氧性异养菌没任何影响;乳酸菌对养殖水体和肠道菌群的影响与抗生素具有相近的效果。[结论]乳酸菌作为饲料添加剂可以取代抗生素应用在草鱼的养殖中。     

阿维菌素·毒死蜱对草鱼的毒性效应研究

[目的]探讨阿维菌素、毒死蜱2种药物对草鱼的毒性效应及相互关系。[方法]以健康活泼的草鱼为试验对象,用阿维菌素、毒死蜱分别对其进行单一药物的急性毒性和2种药物组合和联合毒性试验。[结果]阿维菌素、毒死蜱、2种药物混合对草鱼24、48、72、96h的LC50分别为：阿维菌素0.54、0.49、0.17、0.10 mg/L;毒死蜱0.29、0.21、0.12、0.05 mg/L;阿维菌素与毒死蜱混合药1.22、1.08、0.99、0.86 mg/L;其对草鱼的安全浓度（SC）分别为：0.010、0.005、0.086 mg/L。药物的毒性大小依次为：毒死蜱〉阿维菌素〉混合药。[结论]阿维菌素和毒死蜱混合药的不同浓度对草鱼的生长有显著影响,浓度越高毒性作用越大,低毒性强度的阿维菌素对毒死蜱具缓解作用。     

草鱼脂多糖结合蛋白的分离纯化(英文)

脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding proteins ,LBP)是机体对革兰氏阴性菌感染产生的可溶性急性期蛋白,结合并提呈LPS给细胞表面的模式识别受体,激发免疫反应。在本试验中,用低浓度嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila)感染草鱼(Ctenopharyngodon idellus)24 h后,抽取全血,离心,获得血浆。结合LBP活性检测,经硫酸铵沉淀、CMSephadex C-50阳离子交换层析和DEAE Sephadex A-25阴离子交换层析后,分离纯化得到LBP。该蛋白对异硫氰酸荧光素标记的脂多糖(Fluorescein isothiocyanate labeled li-popolysaccharide ,FITC-LPS)有较强的结合能力。在SDS-PAGE电泳后,考马斯亮蓝染色可见3条明显的带,分子量大约为68、53和48 kDa。同时探索一条简便分离纯化脂多糖结合蛋白的方法,为进一步研究LBP的功能奠定了基础。     

微囊藻毒素-LR对草鱼肝脏超微结构的亚急性毒性影响

微囊藻毒素-LR(microcystin-LR, MC-LR)是一种由蓝藻水华产生的环状肝毒素,对鱼类存在不可忽视的影响.草鱼(Ctenopharyngodon idella)经腹腔注射MC-LR(纯度>98%,50 μg/kg体重),在注射后1、2、7、14和21 d采集肝脏样品,用透射电镜的方法研究发现,MC-LR除可导致线粒体水肿、内质网扩张外,还可引起草鱼肝脏细胞连接间隙增宽,胆汁淤积,炎性细胞浸润,细胞质中大量脂滴及脂褐素、溶酶体增多等一系列的病变;但在注射MC-LR 21 d后草鱼肝脏细胞连接又基本恢复正常.结果表明,MC-LR在低剂量下除了对膜系结构存在影响外,对细胞连接间隙等还存在影响,然而随着时间的延长,这些病变可逐渐修复.     

"肝胆综合症"草鱼血液生化特性及组织结构变化

采用组织学和生物化学的方法,对肝脏肿大、变色草鱼的血液生化指标和肝脏组织结构进行研究。与肝脏正常草鱼相比,肝脏变异组草鱼肝胰脏颜色变淡、甚至变绿;肝细胞发生一定程度的脂肪变性或水样变性,甚至胀亡坏死;血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、直接胆红素（DB）、总胆红素（TB）、甘油三酯（TG）、肌酐（CRE）均显著升高（P〈0.05）,血清尿素氮（BUN）和胆固醇（CHO）含量有增加趋势但不显著（P〉0.05）,血糖（UGLU）含量和碱性磷酸酶（ALP）的含量无显著性差异（P〉0.05）;超氧化物歧化酶（SOD）显著性降低（P〈0.05）,补体C3、C4的活性值都有不同程度的降低（P〉0.05）;肝糖原显著性降低（P〈0.05）,肝中脂肪含量有所增加但不显著（P〉0.05）。结果表明,肝脏外观产生变异草鱼的肝脏有不同程度的损伤,肾脏也受到一定的损害,同时免疫系统也受到破坏。     

氧化鱼油对草鱼幼鱼磷酸酶和转氨酶活性的影响

为研究不同程度的氧化鱼油对草鱼幼鱼体内2种磷酸酶及2种转氨酶活性的影响。选取平均初始体质量为(30.0±2.6)g的健康草鱼幼鱼204尾,随机分成4组,每组3次重复。在草鱼幼鱼饲料中分别添加不同鱼油,分别为对照组(新鲜鱼油,过氧化值4.54 mmol/kg)及鱼油氧化程度逐渐加深的3个氧化鱼油组(OX1过氧化值24.86 mmol/kg,OX2过氧化值72.32 mmol/kg,OX3过氧化值172.73 mmol/kg)。试验58 d后取样,分别测定草鱼幼鱼血清、肝胰脏、脾脏、肾脏等组织中碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、谷草转氨酶(AST)及谷丙转氨酶(ALT)活性,并计算血清和肝胰脏AST/ALT值。结果表明:与对照组相比,3个氧化鱼油组肝胰脏和脾脏中AKP活性显著升高(P0.05),OX3组血清及OX1、OX2组肠道中AKP活性显著升高(P0.05);OX2组肝胰脏和脾脏中ACP活性显著升高(P0.05)。与对照组相比,OX3组血清、OX2组肝胰脏及OX2、OX3组肠道中AST活性显著升高(P0.05),而OX3组肾脏中AST活性显著降低(P0.05);OX1、OX2组背肌及OX2、OX3组肠道中ALT活性显著升高(P0.05);OX3组血清和肝胰脏中AST/ALT值显著升高(P0.05)。综上所述,氧化鱼油对草鱼幼鱼血清及不同组织中的AKP、ACP、AST及ALT活性变化存在较大差异;同时随着鱼油氧化程度加深,草鱼幼鱼各组织细胞受损,免疫功能降低。     

Construction and Characterization of Grass Carp （Ctenopharyngodon idellus） Fosmid Library

Grass carp （Ctenopharyngodon idellus） genomic fosmid library cotaining 129 014 clones was constructed and characterized from one diploid grass carp. The average insert size of the fosmid library was determined to be 35 kb by pulsed field gel electrophoresis, which is 4.1-fold coverage of the grass carp genome. To demonstrate the probability of picking the functional genes from the library, eleven functional genes were screened by three-dimensional PCR technique. The number of positive clones of these genes was from 1 to 6. So, this library may screen any useful genes from grass carp. This grass carp genome fosmid library will be integrated in the presently ongoing efforts to determine the sequence of the grass carp genome.     

草鱼受精卵菌群的研究

对草鱼受精卵及所处水体的好氧及兼性厌氧菌的数量和组成进行了研究.结果表明:草鱼受精卵菌群的数量随受精卵的发育呈递增趋势,刚受精时每个受精卵的细菌数量为1.24×101cfu,出膜前增加到1.41×105cfu.水体中细菌的数量相对稳定,为1.05×104～3.85×104cfu/mL,只在受精卵出膜前的阶段急剧增加,为1.32×106cfu/mL.随受精卵的发育,受精卵的优势菌群先为气单胞菌属(Aeromonas)、肠杆菌科(Enterobac-teriaceae)、微球菌属(Micrococcus)和棒杆菌属(Corynebacterium),后为莫拉氏菌属(Moraxella)和不动杆菌属(Acinetobacter).水体中的优势菌群为气单胞菌属(Aeromonas)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和莫拉氏菌属(Moraxella).受精卵的优势菌群与其所处水体的优势菌群基本相同.