藤茶查尔酮合成酶基因AgCHS1的克隆及功能鉴定

【目的】查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）是植物类黄酮生物合成的第一个关键酶,从藤茶中克隆AgCHS1,分析其序列特征及其在藤茶中的组织表达特异性,通过体外酶活性检测和烟草遗传转化对其功能进行鉴定,为进一步研究藤茶类黄酮累积的调控机理提供理论基础。【方法】根据藤茶转录组测序结果设计引物,以藤茶叶片cDNA和基因组DNA为模板,PCR扩增得到AgCHS1。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA6和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建系统进化树。通过原核表达系统获得AgCHS1的重组蛋白,分析该重组蛋白对底物的催化活性,并通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对酶促反应产物进行鉴定。利用qRT-PCR技术对AgCHS1在藤茶不同器官的表达水平进行分析,并采用硝酸铝比色法测定相应的总黄酮含量变化。构建植物过量表达载体,通过叶盘法转化烟草,筛选阳性转基因后代,对T₂代株系花瓣中的花青素和黄酮醇含量进行检测。【结果】AgCHS1的ORF长1 182 bp,编码393个氨基酸,基因组序列长1 315 bp,含2个外显子和1个内含子。生物信息学分析表明,AgCHS1为稳定的亲水蛋白。通过与其他物种的CHS蛋白多序列比对发现,AgCHS1含有查尔酮合成酶家族的特征序列和活性位点残基,包括丙二酰CoA结合位点和三联活性中心位点,与其他物种的CHS序列一致性较高。系统进化分析显示,AgCHS1与葡萄、山葡萄的CHS处于同一进化分支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,AgCHS1在成熟叶和花中的表达量最高,在老叶中的表达量最低。藤茶不同器官的总黄酮含量与AgCHS1表达水平呈显著正相关。体外酶活性分析显示,重组的AgCHS1蛋白可以催化底物对-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素,说明该蛋白具有查尔酮合成酶活性。获得5株烟草转基因阳性株系,其中2株的花瓣颜色明显加深;与对照相比,转基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别提高56.6%和25.3%,OE3的黄酮醇含量没有显著差异,OE4的黄酮醇含量提高39.1%。【结论】AgCHS1是藤茶中催化合成查尔酮的关键酶,过量表达AgCHS1可以提高转基因植物中花青素和黄酮醇的含量。     

栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

  目的  查尔酮合酶(CHS)是苯丙烷途径的限速酶之一,在植物次生代谢物的合成中起着重要的作用。本研究通过对栾树CHS 基因进行克隆与生物信息学分析,以及分析栾树 CHS 基因表达与类黄酮合成的关系,期望为后续深入研究栾树类黄酮代谢途径其他相关基因、 CHS 基因家族以及锦叶栾呈色机制提供参考。  方法  以栾树叶片为材料,采用RT-PCR技术进行查尔酮合酶基因的克隆并进行生物信息学分析;通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析 CHS 基因在栾树不同组织以及在5月、7月、9月的栾树和锦叶栾叶片中的表达模式;通过代谢组测定筛选出栾树与锦叶栾的类黄酮差异代谢物。  结果  克隆获得两个 CHS 基因的全长DNA,命名为 KpCHS1 和 KpCHS2 。其中 KpCHS1 序列全长为2 492 bp,ORF为1 173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质; KpCHS2 序列全长为1 321 bp,ORF为1 182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质;进一步的序列比对和系统发育分析表明,KpCHS1和KpCHS2蛋白高度同源,具有四个CHS特异性保守基序和一个查尔酮合成酶活性位点; KpCHS1 和 KpCHS2 在栾树根、茎、叶、种子中都普遍表达,其中, KpCHS2 在种子中的表达量最高, KpCHS1 在叶片中表达量高,而在根和茎中,两个基因的表达量相似且较低;表达模式分析显示,在栾树和锦叶栾叶片中,随着月份增加, KpCHS1 的表达量呈现出下降的趋势,而 KpCHS2 表达量未表现出明显的规律。在7月份的叶片样本中, KpCHS1 基因在锦叶栾中表达量显著高于栾树;代谢组结果显示,山奈酚-7-O-葡萄糖苷、7-羟基香豆素、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、以及类黄酮生物合成途径重要的中间产物山萘酚、柚皮苷等黄酮类物质在锦叶栾叶中含量显著升高。  结论   KpCHS1和KpCHS2属于栾树查尔酮合酶家族并且高度同源,但在系统进化树上分布在很远分支上,推测这两个蛋白在氨基酸活性催化功能上可能存在较大差异;KpCHS1和KpCHS2在根、茎、叶、种子中均有表达,且在叶和种子中较高。研究结果初步显示,KpCHS1基因与栾树类黄酮的生物合成高度相关。      

类黄酮物质及查尔酮合酶在油菜性状改良中的作用

类黄酮化合物(Flavonoids)是一类重要的植物次生代谢产物,查尔酮合酶(CHS)是类黄酮物质形成步骤中的一个关键酶,影响植物的多种重要性状.油菜是重要的经济作物,许多植物的CHS基因已经被克隆并进行了基因工程的研究,但CHS与油菜性状发育的关系和分子机理的研究还十分欠缺.本文简略综述了类黄酮物质的结构、分布、功能、CHS基因在类黄酮途径中的重要作用、植物界CHS基因克隆和基因工程的研究进展,重点论述了CHS在油菜的种皮色泽、花瓣颜色、异花传粉、花粉育性、抗紫外线能力、茎表紫色、抗病能力等性状形成中可能的重要作用,并提出了通过对CHS基因的表达调控来改良这些性状的可能性.     

金柑CHS和CHI基因的克隆及表达分析

为了研究查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)和查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)在金柑类黄酮合成过程中的作用,从金柑果实中克隆3个CHS和2个CHI编码基因,构建进化树进行聚类分析;同时采用紫外分光法测定类黄酮含量,并通过qRT-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)进行定量分析。结果表明,FmCHS1和FmCHS2与已知功能CHS紧密聚为一类,界定为CHS蛋白;FmCHS3单独聚类,界定为CHS-like蛋白。FmCHI1界定为类型Ⅰ CHI蛋白,具有CHI酶催化活性,参与类黄酮合成;FmCHI2界定为类型Ⅳ CHI蛋白,在拟南芥中与类型Ⅰ CHI蛋白互作,促进类黄酮合成。在金柑果实发育过程中,类黄酮含量在果皮中呈明显的下降趋势,而在果肉中呈先升后降的变化趋势。FmCHS1和FmCHI1在金柑果实发育中呈高表达模式,且与类黄酮积累模式最为接近。FmCHS1和FmCHI1可能直接参与了金柑果实类黄酮的合成;虽然FmCHI2没有催化功能,但与FmCHI1互作促进类黄酮的合成。     

大豆类黄酮糖基转移酶基因UGT73C19的功能研究

【背景】 类黄酮是大豆中积累的一类重要的植物次生代谢产物,参与大豆的生长、发育和抗逆等诸多生理活动。由UDP-糖基转移酶（UGT）催化的糖基化修饰是类黄酮生物合成的关键步骤。【目的】 通过系统研究大豆UGT73C19编码重组酶的体外酶活特性和体内特性,完善大豆黄酮类化合物合成和积累的机制,为大豆品质的遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】 通过高效液相色谱（HPLC）的方法检测大豆核心种质资源叶片中类黄酮的种类和含量,通过qRT-PCR的方法检测了UGT的表达水平。以大豆Williams 82叶片cDNA为模板,克隆得到UGT73C19的编码区序列。使用MEGA5和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建进化树。通过原核表达系统获得UGT73C19的重组蛋白,分析UGT73C19重组蛋白对各种类黄酮苷元的糖基转移活性,并通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对产物进行鉴定,确定重组蛋白的糖基化位点。利用qRT-PCR技术对UGT73C19在大豆不同组织的表达水平进行分析。构建植物过量表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,获得UGT73C19表达量高的纯合株系,检测转基因株系叶片和种子中类黄酮的种类和含量。【结果】 通过HPLC分析大豆核心种质资源叶片类黄酮成分,发现不同品种中类黄酮的成分和含量存在明显差异。根据类黄酮成分的不同,将大豆核心种质分为12种不同的类型。大豆核心种质资源叶片中总黄酮的含量与UGT73C19的表达水平呈正相关关系。克隆得到UGT73C19的编码区序列,全长1 482 bp,编码493个氨基酸,UGT73C19蛋白在C-端有一个保守的PSPG结构域。体外酶活分析表明,重组的UGT73C19蛋白对6种类黄酮苷元（山奈酚、槲皮素、杨梅素、芹黄素、大豆苷元和染料木素）都具有糖基转移活性,其中对槲皮素的催化效率最高;糖基化位点分别位于类黄酮的5位和7位羟基上,重组UGT73C19蛋白的糖基化底物和位点具有多样性。过量表达UGT73C19的拟南芥叶片和种子中的类黄酮总量明显升高,其中叶片中总黄酮含量提高49%—70%,种子中总黄酮的含量提高34%—37%;尤其是种子中槲皮素3-O鼠李糖的含量显著增加。【结论】 UGT73C19蛋白是催化合成大豆中多个类黄酮糖苷的关键糖基转移酶,过量表达UGT73C19可以提高转基因植物中黄酮醇糖苷和类黄酮的含量。     

细菌Ⅲ型聚酮合酶研究进展

Ⅲ型聚酮合酶（PKS）被认为是结构最简单的聚酮合酶,这一类酶广泛存在于植物细菌和真菌中。随着基因组学的发展,细菌中Ⅲ型聚酮合酶引起越来越多的关注。Ⅲ型聚酮合酶在不同细菌中表现出不同的功能,其产物的结构和生物学活性也各不相同。对细菌Ⅲ型聚酮合酶的生物工程学改造也一直是研究的热点。综述了目前已经完成功能鉴定的细菌Ⅲ型聚酮合酶的研究进展,按照细菌Ⅲ型聚酮合酶产物的不同将其分为五类,并分别论述了各类细菌Ⅲ型聚酮合酶的结构、功能以及特点,对深入研究不同细菌Ⅲ型聚酮合酶以及进行生物工程学改造具有重要意义。     

铁皮石斛查尔酮合酶基因克隆与表达分析

[目的]克隆铁皮石斛中查尔酮合酶(CHS)基因,分析其基本生物学信息及组织表达特异性,为进一步研究CHS基因在铁皮石斛中的表达调控机理及其在铁皮石斛中的功能打下理论基础.[方法]采用铁皮石斛转录组序列与NCBI同源序列进行比对,根据保守区段设计引物克隆铁皮石斛CHS基因的cDNA全长,采用实时荧光定量PCR定量表达分析不同生长年限、不同组织部位中CHS基因的表达水平.[结果]铁皮石斛CHS基因cDNA编码区1188 bp,编码395个氨基酸,GenBank登录号KT783451,分子量为43.2 kD,理论等电点6.05.铁皮石斛GHS氨基酸序列与同属植物金钗石斛(Dendrobium nobile)的CHS氨基酸序列同源性最高,达99%,与非同科植物欧洲大叶杨(Populus trichocarpa)、巨桉(Eucalyptus grandis和紫玉兰(Magnolia liliiflora)等植物的同源性在83%左右.该基因编码的蛋白质属非分泌蛋白,定位于细胞质基质中,为非跨膜结构的亲水性不稳定蛋白.CHS基因在1年生铁皮石斛叶片中的表达量最高,随着植株年龄的增长,叶片中CH基因的表达量降低,茎中的表达量升高.[结论]铁皮石斛CHS基因早期主要参与激素运输和器官形态建成,后期主要参与类黄酮物质合成.     

植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74),是植物类黄酮物质合成途径中的第一个酶,也是植物次生代谢途径中的关键酶之一,对植物具有非常重要的生理意义。为此,综述了查尔酮合成酶基因结构、基因进化、表达调控机理以及诱导因子,概述了查尔酮合成酶基因工程在植物生理方面的研究,并进一步对查尔酮合成酶的分子生物学研究做了展望。     

月季新型PKSⅢ基因的生物信息学分析及原核表达

【目的】对月季Ⅲ型聚酮合酶基因（RcPKSⅢ）进行生物信息学和原核表达分析，为进一步探究该基因的催化功能奠定基础。【方法】以‘月月粉’花瓣为研究材料，从其基因组中筛选月季PKS基因（RcPKSs）家族成员，并对其进行生物信息学分析；利用MEGA软件对RcPKSs与其他植物PKS氨基酸序列进行系统发育分析；利用DNAMAN软件对RcPKSs和紫花苜蓿查尔酮合酶2（CHS2）基因进行序列比对分析；对RcPKSs和紫花苜蓿CHS2活性位点上的氨基酸残基进行比较，分析其催化特征；利用SWISS-MODEL对RcPKSs进行同源建模，并与紫花苜蓿CHS2蛋白三维结构进行比较。利用实时荧光定量PCR方法，分析RcPKSs和间苯三酚甲基化酶编码基因在‘月月粉’花蕾期、半开期和盛开期的表达模式；克隆RcPKSs基因全长，构建其原核表达载体pET-32a-RcPKSs，进行诱导表达，并对重组蛋白进行纯化。【结果】从‘月月粉’基因组中共鉴定出6个RcPKSs，生物信息学分析表明，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3为CHS基因，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6为新型PKSⅢ基因。系统发育分析表明，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3编码CHS蛋白，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6编码新型的非CHS蛋白。序列比对分析表明，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3蛋白与紫花苜蓿CHS2相似度均为72.16%，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6与紫花苜蓿CHS2相似度分别为67.52%，33.85%和32.73%。活性位点上氨基酸残基比较发现，RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3活性位点上氨基酸残基均保守，RcPKS4氨基酸残基在起始口袋和延伸口袋处发生替换，RcPKS5和RcPKS6氨基酸残基均在延伸口袋处发生替换。对RcPKSs蛋白质结构的分析结果显示，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6蛋白质采用了几乎相同的αβαβα三维整体折叠形式。实时荧光定量分析表明，RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6表达量在‘月月粉’花朵盛开期最高，间苯三酚O-甲基转移酶基因（POMT）、苔黑酚O-甲基转移酶基因1（OOMT1）和OOMT2表达量在盛开期最低。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明，重组蛋白诱导并且纯化成功。【结论】鉴定了‘月月粉’新型RcPKSⅢ基因，该基因可能参与花发育调控过程。克隆了RcPKSs基因，并诱导表达获得了RcPKSs重组蛋白。     

真菌聚酮合酶基因研究进展

真菌聚酮化合物是一类重要的次生代谢产物,其结构和功能多样,生物学活性广泛.聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)是催化聚酮化合物合成的关键酶.近几年,随着基因组测序技术、分子生物学技术和遗传分析工具、表达宿主、重组酶制剂等的发展,真菌聚酮合酶基因的研究取得了许多新的进展.文章对近年来在真菌聚酮合酶基因获得、基因功能验证及真菌聚酮合酶基因工程方面的研究进展进行了综述,并对该领域的研究热点进行了展望.     

Isolation and expression analysis of NtCHS6, a new chalcone synthase gene from Nicotiana tabacum

Chalcone synthases(CHS, EC 2.3.1.74) are key enzymes that catalyze the first committed step in flavonoid biosynthesis. In this study, we isolated a chalcone synthase, named NtCHS6, from Nicotiana tabacum. This synthase shared high homology with the NSCHSL(Y14507) gene and contained most of the conserved active sites that are in CHS proteins. The phylogenetic analysis suggested that NtCHS6 protein shared a large genetic distance with other Solanaceae CHS proteins and was the most closely-related to an uncharacterized CHS from Solanum lycopersicum. The expression analysis indicated that NtCHS6 was abundantly expressed in leaves, especially in mature leaves. By scrutinizing its upstream promoter sequences, multiple cis-regulatory elements involved in light and drought responsive were detected. Furthermore, NtCHS6 expression decreased significantly under dark treatment and increased significantly under drought stress. Our results suggested that NtCHS6 expression exhibited both light responsiveness and drought responsiveness, and might play important roles in ultraviolet protection and drought tolerance.     

紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析

【目的】从紫色马铃薯中克隆CHS的cDNA全长序列,并分析其组织表达水平以及诱导剂处理后基因的表达与花青素含量积累之间的关系。【方法】采用RT-PCR和RACE方法克隆紫色马铃薯CHS的cDNA全长序列,通过在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析,半定量RT-PCR检测StCHS在紫色马铃薯组织中的表达特异性以及蔗糖和赤霉素处理后StCHS的表达。采用分光光度计法测定紫色马铃薯花青素含量。【结果】克隆获得紫色马铃薯CHS的cDNA全长1 490 bp,包含1 170 bp的ORF,该基因编码389个氨基酸。推测StCHS蛋白含有Cys164、Phe215、His303和Asn336 4个活性位点,构成CHS蛋白的催化中心。StCHS的表达具有组织特异性,在茎、叶柄和叶中表达较强,在根、块茎和叶轴中几乎检测不到CHS的表达。赤霉素能促进CHS的表达从而促进花青素的积累;蔗糖能够显著促进紫色马铃薯花青素的积累,但对CHS的表达影响不明显。【结论】从紫色马铃薯中克隆获得CHS的cDNA全长序列,该基因表达具有组织特异性,StCHS是紫色马铃薯花青素合成途径中的一个限速酶基因。     

水分胁迫对三叶青叶绿体超微结构及黄酮合成关键酶的影响

  目的  探究水分胁迫对三叶青Tetrastigma hemsleyanum叶绿体超微结构及黄酮合成关键酶活性的影响,有利于提升三叶青的品质。  方法  以2年生三叶青实生苗为材料,通过控水盆栽试验(设置水涝、干旱和对照),分析水分胁迫对三叶青叶绿体超微结构、块根总黄酮质量分数以及黄酮合成途径中的3个关键酶[苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)]活性的影响。  结果  干旱和水涝均引起三叶青叶片叶绿体数量减少,叶绿体质体小球的数量增多、体积变大、颜色变浅,叶绿体基粒片层结构不再整齐紧密;干旱时,三叶青总黄酮质量分数在胁迫12 d达到峰值,水涝时则在胁迫16 d达到峰值,而PAL、CHS和CHI等3个关键酶则在黄酮质量分数达到峰值前期或者是同期表现出较高的活性;随着胁迫时间的延长,黄酮质量分数和关键酶活性都有不同程度的下降,黄酮质量分数与PAL、CHS、CHI活性均显著相关(P＜0.05)。  结论  适度的水分胁迫可提高三叶青块根中黄酮类化合物的质量分数以及相关酶的活性。图7表1参36     

红树植物秋茄查尔酮合酶基因克隆及其在盐胁迫下的表达分析

以秋茄(Kandelia candel)叶片为试验材料,采用RT-PCR的方法获得秋茄查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因的cDNA序列,命名为KcCHS,GenBank登录号为KX673194.1.序列分析结果表明,KcCHS基因的cDNA序列长度为1170bp,编码389个氨基酸,属于CHS超家族.序列比对结果显示,秋茄与其他物种的CHS基因核苷酸序列具有较高的相似性,平均达到80%以上.系统进化分析显示,KcCHS基因与余甘子CHS基因亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析表明,秋茄叶片KcCHS基因的转录水平随着NaCl浓度的升高而上升.此外,随着NaCl浓度的升高,黄酮类化合物的含量显著增加,羟自由基清除率也明显提高.     

Probing steric and hydrophobic effects on enzyme-substrate interactions by protein engineering

Steric and hydrophobic effects on substrate specificity were probed by protein engineering of subtilisin. Subtilisin has broad peptidase specificity and contains a large hydrophobic substrate binding cleft. A conserved glycine (Gly(166)), located at the bottom of the substrate binding left, was replaced by 12 nonionic amino acids by the cassette mutagenesis method. Mutant enzymes showed large changes in specificity toward substrates of increasing size and hydrophobicity. In general, the catalytic efficiency (k(cat)/K(m)) toward small hydrophobic substrates was increased (up to 16 times) by hydrophobic substitutions at position 166 in the binding cleft. Exceeding the optimal binding volume of the cleft ( approximately 160 A(3)), by enlarging either the substrate side chain or the side chain at position 166, evoked precipitous drops in catalytic efficiency (k(cat)/K(m)) (up to 5000 times) as a result of steric hindrance.     

不同植物查尔酮合成酶CHS基因的生物信息学分析

采用生物信息学方法对GenBank中已登录的10种不同植物中的查尔酮合成酶基因的核苷酸序列及所推测的氨基酸序列的理化性质、信号肽、跨膜结构、亲/疏水性、功能结构域以及其二级结构进行了详细的分析,构建了不同植物CHS的系统进化树。结果表明,10种植物中CHS基因的开放阅读框的全长在1.2 kb左右,大约编码399个氨基酸;不同植物中的CHS的氨基酸序列均包括1个N-糖基化位点(32NMSS),4个蛋白激酶c磷酸化位点(69TIR、158SVK、202TFR、359SAK)和1个查尔酮合成酶活性位点(161RLMMYQQGCFAGGTVLR),均不存在信号肽、无跨膜结构域,是一个疏水性蛋白。     

Tinkering with enzymes: what are we learning?

It is now possible, by site-directed mutagenesis of the gene, to change any amino acid residue in a protein to any other. In enzymology, application of this technique is leading to exciting new insights both into the mechanism of catalysis by particular enzymes, and into the basis of catalysis itself. The precise and often delicate changes that are being made in and near the active sites of enzymes are illuminating the interdependent roles of catalytic groups, and are allowing the first steps to be taken toward the rational alteration of enzyme specificity and reactivity.     

毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析

中链酰基辅酶A合成酶(MACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,催化中链脂肪酸与辅酶A结合形成相应的中链酰基辅酶A。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的4CL基因,克隆得到毛果杨PtMACS1的基因序列(基因编号:estExt_fgenesh4_pg.c_640066)。通过序列分析可知,Box I和Box II两个在4CL中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将PtMACS1与原核表达载体 pET-30a(+) 构建融合表达载体PtMACS1- pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析,研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸、壬酸、癸酸显示出明显活性:Kcat分别为(1302.65)、(1933.46)、(2015.51) mol/(minmg),以该蛋白的最适底物癸酸测得该蛋白的最适反应温度为37 ℃,最适反应pH为7.0。该结果表明,PtMACS1属于毛果杨中链酰基辅酶A合成酶家族一员,为后续毛果杨腺苷酸合成酶超基因家族的鉴定及分类分析提供资料。